不同pH 和培养方式对海带配子体生长发育的影响

陈书秀，李晓捷，李霞，孙娟，赵楠，史良

（山东东方海洋科技股份有限公司，国家海藻与海参工程技术研究中心，山东省海藻与海参技术创新中心，山东省海藻遗传育种与栽培技术重点实验室，山东 烟台 264003）

海带是一种具有很高营养价值和经济价值的大型褐藻，也是最早实现全人工养殖和育苗的藻类之一，在食品、化工、药用等的市场需求量日益增加。海带养殖也在防治赤潮，促进海区生态平衡方面起到重要的作用。因此，海带养殖具良好的发展前景。苗种繁育是海带大规模养殖的前提，目前采用的育苗方式主要有两种:以海带生活史为依据的传统夏苗培育和以海带配子体特性为依据的克隆育苗方法。与前者相比，克隆育苗方法工艺简单，品种纯度较高，且不受季节限制，是推动海带育苗产业化的新模式。

配子体克隆育苗方法主要由配子体大规模培养、采苗和育苗管理3 部分构成，其中配子体人工高密度培养是该方法产业化的关键。目前已对配子体种质资源的保存[1-3]、培养条件[4-10]、扩培方法[11-14]等进行了大量研究，得出了海带配子体适宜生长的温度、光照及所需氮磷浓度范围；可采取的扩培方法有打碎接种和通气悬浮培养等。配子体培养不仅需要N、P、Fe 等营养的供应，无机碳也是配子体生长利用量最大的营养成分之一。岳国峰等[13,14]研究发现，海带雌雄配子体只能利用游离的CO2作为碳源。海水中游离的CO2仅占无机碳总量的0.5%，当海带配子体高密度培养时，无机碳必将成为最主要的限制因子。目前采用通空气悬浮培养方法，主要作用是搅拌混匀和防止氧积累，对无机碳的补充作用不大。海水总无机碳浓度主要由温度、碱度、盐度和pH 决定，在其他条件一致的情况下，pH 可直接显示无机碳的变化[15]。随着无机碳浓度的改变，所引起的pH 的变化也会对海藻的生长发育产生一定的影响[16-19]。因此，在补充无机碳的过程中，必须保证pH 变化范围与所培养海藻的适应范围相一致。

海带“奔牛”是荣成等养殖时间较长、较广的海带品种，是中国海洋大学刘涛教授及其团队与山东寻山集团公司历时5 年（2006—2011）联合培育出的优良海带品种，其与海带亲缘关系很近[20,21]，与海带的分化未达到种的水平，仍属于海带[22]。该研究尝试在此海带配子体通空气高密度连续培养过程中，以CO2配气装置补充无机碳源，并通过控制培养液的pH 调整CO2的补充量及补充频率，使海带配子体在充足的碳源和适宜的pH 的范围内生长，提高海带配子体的生长率，以期为海带配子体高密度培养提供一种更加高效的方式。

1 材料与方法

1.1 材料

取自实验室保存的海带‘奔牛’雌雄配子体在8℃～10℃、24 h 光照和光照强度30 μmol/（m2·s）下加富灭菌海水（10 mg/L NaNO3-N，1 mg/L KH2PO4-P）培养。

1.2 方法

1.2.1 配子体克隆的处理

取适量的雌雄配子体于容积为5 000 mL 的加入3 000 mL 灭菌海水的三角瓶中，利用小循环泵破碎处理10～15 min。粉碎后细胞液经300 目筛绢过滤，使雌雄配子体细胞段大小基本达到2～5 个细胞。

1.2.2 不同pH 对海带配子体生长的影响

将处理过的雌雄配子体分别等体积、等密度加入于培养皿中，让其自然附着于载玻片上。在海水中添加NaNO3和KH2PO4，总有效N 为10 mg/L，有效P 为1 mg/L 作为培养液。培养条件为：24 h 光照、光照强度40 μmol/（m2·s）、温度为10℃。3 d 后更换不同初始PH（6.0、7.0）的培养液，以正常海水（pH8.2）培养液为对照组（组③），初始pH6.0 为组①、初始pH7.0 为组②。每6 h 测定pH 并更换培养液，经过30 d 培养之后，拍照（Olympus Ⅸ51）,并采用Image-pro 统计数据。每个处理组设3 个培养皿，每个培养皿测定了3 个数据，即每个处理组共记录9 个数据（n=9）。根据初始配子体平均长度（L0）和实验结束时配子体平均总长度（L1）计算相对生长速率（RGR，%/d），即RGR=100×［ln（L1）－ln（L0）］/t，其中t 为试验天数（d）。pH 采用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 调节，用pH 计测定。

1.2.3 不同培养方式对海带配子体生长的影响

在18.9 L 矿泉水桶（有效水体15 L）中，以0.5 g/L 的密度接种处理过的海带雌雄配子体。在海水中添加NaNO3和KH2PO4总有效N 为10 mg/L，有效P 为1 mg/L 作为培养液。在24 h 光照，光照强度40 μmol/（m2·s），温度为10℃条件下培养。每5 d 更换一次培养液，15 d 时克隆液倒入筛绢过滤至不滴水时测量鲜重，计算特定生长率（SGR）。计算公式SGR=100%×[ln（W2）-ln（W1）]/（t2-t1），其中W1=起始重量，W2=结束重量，t1=起始时间，t2=结束时间。利用pH 计测定培养液48 h 的pH 变化。采用3 种培养模式，每种培养模式设置3 个重复。

具体方式如下：Ⅰ：静置培养，每天摇瓶3 次，避免配子体克隆贴于瓶底；Ⅱ：通空气悬浮培养，充气机和培养容器之间安装空气过滤系统，充气速率为400 mL/min，充气频率为每30 min 充气5 min，每天共充气24 次，以观察到克隆上下翻转为准。Ⅲ：定时定量补充CO2进行悬浮培养：在培养方式Ⅱ的基础上，每2 d 每桶用纯CO2压力罐补充CO2（1～2 min），直到培养液pH7.0，充气量为120 L/h。

1.2.4 不同配子体扩增培养方式对海带配子体发育的影响

取1.2.3 实验中3 种继代培养方式培养60 d 的海带雌雄配子体，分别用300 目筛绢过滤，获得含2～5 个细胞的细胞段悬浊液，然后每组的雌雄配子体按照质量比2∶1 的比例混合均匀。取一定量的雌雄混合悬浊液加入到12 cm（直径）的培养皿中，放置在温度10℃，盐度31，光照强度30 μmol/（m2·s），光照周期均为10L∶14D 条件下培养。在海水中添加NaNO3、KH2PO4、柠檬酸铁作为培养液，培养液中总有效氮为10 mg/L，有效磷为1 mg/L，有效铁为0.5 mg/L。每个处理组3 个重复。每个培养皿随机观察10 个100×视野，分别统计卵囊形成、排卵、幼孢子体和总细胞数，按卵囊形成数、排卵数和孢子体数之和占总细胞数的百分比计算发育率。

1.3 统计分析

2 结果与分析

2.1 不同pH 对海带配子体生长的影响

间隔6 h 更换调整一次，处理组①、②、③的pH分别维持在6.0～6.1、7.0～7.1，及8.2～8.3。

由表1 可知，所用模型有统计学意义。pH（P<0.001）、性别（P<0.05）对海带’配子体生长有显著影响，但pH 与性别的交互作用对海带配子体生长无显著影响（P>0.05）。Eta2pH>Eta2性别，表明pH对海带’奔牛’配子体克隆生长的影响大于性别的影响。pH 及性别对海带配子体的生长有显著影响。

表1 不同pH、性别对海带’奔牛’配子体生长影响的方差分析Tab.1 Variance analysis of effects of different pH values and sexuality on the growth of kelp S.japonica’Benniu’gametophytes

图1 为雌雄配子体克隆的相对生长率在不同处理组的变化情况。结果显示，处理组①（pH6.0～6.5），雌雄配子体相对生长率[♀（4.61±1.28）%，♂（3.35±1.23）%]显著低于其他2 组，雌配子体的相对生长率（4.61±1.28）%显著高于雄配子体（3.35±1.23）%。处理组②（pH7.0～7.3）雌雄配子体的相对生长率与对照组③无显著差异（P>0.05），且在2 组培养条件下，雌、雄配子体的相对生长率无显著差异（P>0.05）。

图1 不同pH 下海带’奔牛’雌雄配子体相对生长率Fig.1 Relative growth rate of female and male gametophytes of kelp S.japonica’Benniu’exposed to different pH values.Data are shown as means and SD（n=3）

2.2 不同培养方式及性别对海带’奔牛’配子体生长的影响

48 h 内培养方式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ培养液的pH 变化范围分别为8.2～8.9，8.2～8.8 和7.0～8.3（图2）。

图2 海带配子体培养液48 h 内pH 变化Fig.2 The range of medium pH during 48 h

由表2 可知，所用模型有统计学意义，即培养方式（P<0.001）及性别（P<0.001）极显著影响海带’奔牛’配子体克隆的生长，但培养方式与性别的交互作用对海带配子体克隆生长无显著影响（P>0.05）。Eta2培养方式的影响>Eta2性别的影响，即培养方式对配子体克隆生长的影响大于性别。

表2 不同培养方式、性别对海带’奔牛’配子体生长影响的方差分析结果Tab.2 Variance analysis of effects of different culture methods and sexuality on the growth of gametophytes in kelp S.Japonica‘Benniu’

不同实验组的雌雄配子体克隆的特定生长率不同。静置培养方式下，雌雄配子体特定生长率（♀10.03%，♂9.21%）显著低于其他2 种培养方式。在3 种培养方式条件下，雌配子体（10.03%～15.41%）的特定生长率显著高于雄配子体（9.21%～13.70%）。在补充CO2+通空气悬浮培养条件下，雌雄配子体的特定生长率（♀15.41%；♂13.70%）显著高于其他2种培养方式（图3）。

图3 不同培养方式下海带’奔牛’雌雄配子体特定生长率Fig.3 Specific growth rate of female and male gametophytes in kelp S.japonica‘Benniu’under the different cultivation methods.Data are shown as means and SD（n=3）

2.3 不同配子体扩增培养方式对海带配子体发育的影响

在3 种配子体扩增培养方式下培养60 d 的配子体均可正常发育，且各组间的发育率无显著差异（P>0.05，表3）。随着发育时间的延长，各组的发育率显著增加（发育时间P<0.001，表3）。3 种扩增培养方式培养的配子体均在第14 d 出现卵囊并排卵（表4），第27 d 的小苗率均在60%以上，最终发育率无显著差异（P>0.05，表5）。

表3 不同配子体扩增培养方式及发育时间对海带’奔牛’配子体发育影响的方差分析结果Tab.3 Variance analysis of effects of different culture methods and development periods on the development of kelp S.Japonica‘Benniu’gametophytes

表4 不同扩增培养方式对海带’奔牛’配子体发育的影响Tab.4 Effects of different culture methods on gametophyte development rate of kelp S.japonica ’Benniu’n=3;D；%

表4 不同扩增培养方式对海带’奔牛’配子体发育的影响Tab.4 Effects of different culture methods on gametophyte development rate of kelp S.japonica ’Benniu’n=3;D；%

表5 不同扩增培养方式对海带’奔牛’配子体发育率的影响Tab.5 Effects of different culture methods on gametophyte development rate of kelp S.japonica ’Benniu’.Data are shown as means and SD（n=3）n=3;（D；%

表5 不同扩增培养方式对海带’奔牛’配子体发育率的影响Tab.5 Effects of different culture methods on gametophyte development rate of kelp S.japonica ’Benniu’.Data are shown as means and SD（n=3）n=3;（D；%

注：同一列上的相同大写字母表示发育率在相同培养时间不同培养方式下差异不显著（P>0.05）；同一行上的不同小写字母表示发育率在相同培养方式不同培养时间差异显著（P<0.05）。Note:Means with the same capital letters in the same column are not significant differences between culture methods（P>0.05）;means with the different letters in the same line are significant differences between sampling times in the same culture method（P<0.05）.

3 讨论

3.1 不同pH 和培养方式对海带配子体生长的影响

海水中的无机碳是海洋藻类生长利用量最大的营养成分之一，是进行光合作用的必需碳源，但不同藻类利用无机碳的形式不同，不同藻类即使在相同生长条件下所利用的无机碳浓度也不尽相同[13-15,23-25]。岳国峰等[13,14]比较了海带配子体和幼孢子体无机碳素营养的利用，发现海带雌雄配子体只能利用游离的CO2为碳源，海水中CO2浓度的升高有效加快了雌雄配子体利用无机碳的速度；还发现海水pH 升高会抑制海带配子体对无机碳的利用。pH8.7 时配子体对无机碳的吸收利用率降低40%。本实验结果表明，pH（P<0.001）显著影响海带’奔牛’配子体生长，pH7.0～7.5 组配子体相对生长率最高。静置培养与传统通空气悬浮培养条件下的特定生长率也显著低于补充CO2培养组，前者的pH 在48 h 达到8.7～8.9，这可能是配子体生长受限的重要因素之一。海水总无机碳浓度主要由温度、碱度、盐度和pH 决定，在其他条件一致的情况下，pH 可直接显示无机碳的变化。Skirrow 等[15]研究表明，天然海水中（pH8.1～8.3），CO2浓度随着pH 的升高而逐渐降低，当pH 接近于9 时，游离CO2浓度接近于0。因此，静置培养与传统通空气悬浮培养条件下的pH 达到8.7～8.9，表明培养液中CO2已成为限制因素，若不及时更换培养液，配子体生长将会受到抑制。

该实验尝试在传统通气悬浮培养的基础上定时定量补偿CO2，将培养液pH 持续稳定在7.0～8.4左右，并保持CO2的含量一直处于较高的水平，由此保证碳源充足，减少pH 升高引起的负面效应。结果表明，该方法培养的配子体特定生长率显著高于其他2 组。此结论与张栩等[26]结论相同，但与之相比，本文所采用的补充CO2的方法简单易操作，节约成本，更有利于在育苗基地推广使用。

3.2 不同pH 和培养方式对海带配子体发育的影响

CO2进入海水后，会发生一系列化学反应，改变海水酸化和酸碱度平衡等，不可避免地影响海水中的海藻等初级生产者。高浓度CO2对海藻的生长速率、光合作用、呼吸作用、生化组分、营养盐的吸收等都有显著影响，且存在明显的种间差异[27-32]。这些差异性不仅与藻体无机碳利用机制有关，也有可能是CO2加富使水体中pH 下降引起。如pH 降低会对某些褐藻的生长和光合作用造成较大的负面效应[33]，也会影响海带如巨藻（Macrocystis pyrifera）等早期生命史阶段游孢子萌发、配子体性别比例、配子体发育等[16-19]。Roleda 等[17]研究表明，pH 降低至7.59～7.60，巨藻游孢子的萌发率显著降低，配子体生长也受到一定的抑制，但同时加入可溶解无机碳，有效减少了pH 降低引起的这种负面效应。Leal等[19]研究发现，pH 降低提高了巨藻和裙带菜（Undaria pinnatifida）游孢子的萌发率，促进了配子体的生长，对配子体性别比例及其后期发育无显著影响。该研究表明，适量增加海水培养液中CO2对海带配子体生长有明显的促进作用；当配子体长期处在pH<7 的环境中，生长显著受抑制。

为了检验配子体长期在较高浓度CO2的海水培养液中生长，是否会对其发育能力产生不利的影响。以在3 种不同方式下培养60 d 的海带’奔牛’雌雄配子体以质量比2∶1 混合后，在适宜条件下进行了发育培养，实验结果显示，3 种培养方式下培养的配子体均可正常发育，发育进程及发育率无显著差异。由此可以看出，在传统通空气扩增培养的基础上，根据培养液pH 变化，定时定量补充CO2可以用于海带配子体大规模高密度培养，与光生物反应器相比，成本低廉，操作简便，适合在育苗基地大规模推广。

3.3 结论

比较发现：配子体生长的最适生长pH 范围为7.0～8.3。其次从配子体培养成本出发，通空气悬浮培养过程中每2 d 补充一次CO2，利用纯CO2压力罐（出气量：120 L/h）向15 L 海水中充气1～2 min，保证了充足的碳源，使培养液pH 范围控制在7.0～8.4，排除了pH 对配子体生长不利影响，避免了频繁测定pH 对配子体的混种或杂藻等污染。发育实验检验了该方法使配子体长期处在较高浓度CO2的海水培养液中生长，并未对其发育能力产生不利的影响。该方法可用于海带配子体大规模高密度培养成本低廉，操作简便，适合在育苗基地大规模推广。