鱼类细胞系研究现状

景宏丽，孔玉方，袁向芬，张旻，王娜，陈冬杰，吴绍强

（中国检验检疫科学研究院，北京 100176）

在已知的脊椎动物种群中，鱼类约占48%，鱼类细胞作为脊椎动物组织和细胞模型应用于多个生物学科，是一个巨大资源[1]。鱼类细胞系作为实验材料，比活鱼实验具有便捷、经济、易操作和重复性好等优点。对比人和哺乳动物离体培养的细胞株，鱼类细胞株平均传代100 代仍可继续分裂，且来源于成鱼的细胞系仍具有分裂能力。本文归纳整理了近年新建鱼类细胞系的数据，综述了鱼类细胞系组织来源、培养方法及应用现状，以期为鱼类细胞系研究提供最新的参考数据。

1 国内外鱼类细胞系构建情况

自1962 年Wolf 和Quimby 建立了第一个鱼类细胞系—虹鳟（Oncorhynchus mykiss）性腺细胞系（RTG-2）[2]以来，鱼类细胞系应用已有60 年的历史。截至目前，至少建立和应用了826 株细胞系[3]。这些细胞系分别来源于约74 科186 种鱼类的不同组织，其中鲤科的鱼类种类最多，约27 种，但是来源于虹鳟的细胞系数量最多，约为73 株。淡水鱼类和溯河洄游性鱼类约525 株，分别来源于42 科的105 种鱼类的不同组织；而海水鱼类及咸水鱼类的细胞系约为301 株，分别来源于约32 科的81 种海水鱼类的不同组织。该数据与张博等[4]报道鱼类隶属科的数量有所减少，但是，鱼类种类和数目都增加。特别是来源于海水鱼类种类和数目明显增加。目前鱼类细胞培养已实现从淡水鱼类扩展到海水鱼类，相信未来会扩展到其他水生动物，会建立更多种类细胞系，形成丰富细胞系资源库。

我国学者新建的部分细胞系并未统计在内。据统计，截至2010 年上半年，我国已经建立的鱼类细胞系约70 株[4]。笔者进一步统计，在2011—2021 年间中国学者公开发表的新建且能稳定传代的鱼类细胞系约94 株，分别来源于53 种鱼类不同组织（表1）。在2011—2021 年新建立细胞系报道中，至少80%由亚洲学者报道，这与Lakra 等[1]结果类似。这些亚洲学者中中国学者居多，其次是印度。中国学者已然成为全世界新建细胞系研究领域主要贡献者。

2 细胞系的组织来源

细胞系建立是一个漫长复杂的过程，会因为取组织时出现污染而造成试验失败，因此建立细胞系通常选择比较容易获得的正常鱼类组织。目前已经报道的组织或器官有肝脏、肾脏、脑、鳍条、皮肤和性腺等。在2011—2021 年间，本文统计的94 株的国内鱼类细胞系中，来自鳍条组织细胞系有26 株，占新建细胞系27.66%；来自脑组织细胞系14 株，占新建细胞系14.89%；来自肾组织细胞系14 株，占新建细胞系14.89%；来自性腺组织细胞系10 株，占新建细胞系9.4%。由此可见，鳍条是建立细胞系最常选择的组织之一，这是由于取鳍条组织不用杀死成鱼，且鳍条组织的再生能力很强，离体培养细胞增殖活性强[5]。

为了能够更好发挥鱼类细胞系作用，鱼类组织来源除了选取常见组织，还会根据需求选取特殊组织构建细胞系。如关柠楠等[67]建立团头鲂骨组织细胞系；魏钰娟等[68]建立异育银鲫脊髓组织细胞系。

国内外鱼类细胞建系建立虽然已经取得了很大进步，但并不是所有的鱼类组织都能够构建稳定可传代的细胞系，如付思思等[6]在锦鲤组织细胞体外培养的初步研究中，鳍条细胞系已传至第39 代，但心脏和肌肉细胞系分别停留在第2 代和第4代。建议应根据实际需要和组织特性合理选择用于细胞培养的组织来源，否则不能获得预期的细胞系。

3 鱼类细胞系原代培养方法

鱼类细胞培养分为原代培养和传代培养两个阶段。原代培养是细胞培养的起始而最关键的阶段。细胞原代培养方法有多种，如组织块法、机械分离法、络合剂分散法、酶消化法、悬浮细胞培养法和微载体细胞培养法等[5]。近年数据显示，酶消化法和组织块法使用频率最多。目前采用酶消化法建立的鱼类细胞系已有较多报道，如Liu 等[25]建立了石斑鱼的脑细胞系；Xu 等[26]建立了鲫的脑细胞系；Jing等[37,59]建立了金鱼吻端、肾脏和心脏细胞系；张莹莹等[38]建立了金钱鱼的肾细胞系；周佳楠等[66]建立了金钱鱼鳃细胞系。采用组织块法成功建立的细胞系有锦鲤的鳍条细胞系[6]、斑石鲷的肌肉、脑和肝细胞系[27,28]、大菱鲆的脑和心脏细胞系[29,60]等。

虽然以上两种细胞原代培养方法均得到了广泛应用，但研究数据显示，相同组织细胞系使用原代培养方法并不是单一固定在酶消化法或组织块法上，即不具有专一性。如建立皮肤细胞系研究中，来源于中华鲟、牙鲆、石斑鱼的皮肤细胞系使用了组织块法[5,56,57]，而中华鳑鲏的皮肤细胞系使用了酶消化法[58]；在脑细胞系研究中，来源斑石鲷、鳜和大菱鲆的脑细胞系使用组织块法[28-30]，来源金鱼、鲫、卵形鲳鲹和锦鲤的脑细胞系使用酶消化法[26,31,32]；在性腺细胞系研究中也有类似报道[48-50]。除了以上两种原代培养方法，在建立鱼类的胚胎细胞系研究中使用了机械分离法[65]。尽管现有的细胞培养技术较为成熟，且获得了重要成果，但还有相当多的鱼类组织器官的细胞培养至今尚未成功。这就需要不断开发新的原代细胞培养技术来解决这一难题。

4 培养基和添加剂的选择

要建立鱼类细胞系，从组织到细胞延伸是决定细胞系能否建成的关键步骤之一，整个过程中主要营养来源就是培养基。因此选择合适培养基至关重要。培养基组成包括基础培养基、血清、抗生素和促细胞生长因子等。细胞系不同时期需要成分有所不同，但是基础培养基和血清是必备成分。

目前常见的基础培养基包括Dulbeccos Modified Eagle Medium（DMEM）、Medium 199（M199）、Leibovitz-15（L-15）、Dulbecco's Modified Eagle Medium:Ham's F-12（DMEM:F12）和Minimum Essential Medium（MEM）。每种培养基适用细胞系不同，如DMEM 基础培养基的营养成分高于MEM 基础培养基，其根据糖的含量又分为高糖DMEM 和低糖DMEM，适合培养增殖活跃的细胞[5]；M199 所含营养成分达60 多种，在淡水鱼细胞培养中比较常见[37,59]；L-15 培养基采用半乳糖作为糖源，且丰富了氨基酸组成成分，在细胞培养过程中不用添加CO2，海水鱼类细胞系的培养使用较多[25]。DMEM/F12是Ham’s F12 与DMEM 以1∶1 的比例混合培养基，适用于培养增殖活力较弱的细胞[28]；MEM 培养基含有多种必需氨基酸和维生素，适用于培养要求不太高鱼类的细胞[45,51]。这些商品化培养基产品多数是由国外厂家授权后国内生产商生产的，但是未见有国内学者自主研发商品化培养基报道，希望未来能对此做些研究，生产我国自有品牌的培养基，提高我国在细胞培养基产品市场上的竞争力。

在建立细胞系之初，选择基础培养基一般是根据来源组织确定培养基。但近年来研究显示，来源于同一种族同一组织的细胞系使用的培养基有所不同。王艺舟等[5]建立青鱼鳍条组织细胞系使用的是DMEM 培养基，张雪萍等[7]则使用的是L-15。来自不同种族同一组织的细胞系则可以使用相同的培养基。如来源于金鱼和鲫鱼的脑组织建立细胞系都可以使用M199 培养基[26]。当然，也有报道显示，来源不同种类同一组织细胞系使用不同的培养基[8,17,39]。同一个细胞系也可以在多种培养基中生长。李苗苗等[40]建立鳗鲡肾脏细胞系时，发现DMEM/F12 和L15 培养液均适合其正常生长和增殖,而在MEM 培养液中无法正常生长。以上说明，在建立原代细胞系时，培养基的选择不具有一定的规律性。因此，在建立细胞系初期，可以多选择几种培养基进行原代培养。在细胞系建立后，培养基必须优化，通过优化培养基选择出适合培养该细胞系的培养基。

血清是细胞培养最重要的一种营养添加物。鱼类细胞系最常用血清是胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）。纵观近年来细胞培养中胎牛血清添加量来看，仅傅永明等[18]在建立二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系时，使用的血清浓度为30%，通常使用的浓度范围在10%～20%。这主要是因为血清浓度过高，对细胞产生毒性，不利于细胞系生长。随着细胞代数增加，细胞系状态变为稳定时，血清的浓度会降至10%左右[45]。为了细胞更好的贴壁生长，在鱼类细胞系培养时除了加FBS 外，还添加一定浓度的鱼血清和胚胎提取液[5]。

除了血清，另一种重要的添加物是生长因子。目前常用生长因子包括表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、血小板和胰岛素生长因子（insulin-like growth factor-I，IGF-I）等。Sun 等[48]通过添加bFGF、EGF 和IGF-I 促进来源半滑舌鳎的性腺细胞生长。郑媛等[45]在来源半滑舌鳎的细胞培养过程中添加了bFGF。单莉娟[41]在松江鲈细胞培养过程中添加bFGF 和EGF。

在鱼类细胞培养过程中还会经常加入其它辅助成分，如Sun 等[48]加入了β-琉基乙醇，可以直接刺激细胞分裂增殖并保护细胞免受氧化损伤；齐文闯等[49]加入的白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）有利于维持细胞未分化状态。

以上培养基和添加剂在鱼类组织启动原代培养时承启着重要的作用，但是在传代培养中也易出现细胞增长过快产生细胞死亡。建议在细胞系进行传代培养中要及时调整培养基和添加剂剂量。当然，考虑培养基和添加剂成分越简单，越有利于后期细胞系的推广应用，鱼类细胞系在后期传代过程动物源、无蛋白和化学成分限定培养基）培养细胞系。这是漫长而复杂过程，一旦成功，将开启鱼类细胞系发展史上新纪元。

5 细胞系的应用

随着鱼类细胞系发展，其被广泛应用于病毒学、免疫学、内分泌学、肿瘤学、细胞工程等研究领域。近年报道显示，新建的鱼类细胞系主要应用在鱼类病毒学研究。这也是鱼类细胞系建立的初衷。

自Wolf 首次利用鱼类细胞系成功地从鳟性腺细胞系中分离出第一株鱼类病毒传染性胰脏坏死病毒后[2]，紧接着越来越多的鱼类病毒从鱼类细胞中成功地分离和鉴定，这为鱼类疾病的研究奠定了基础。鳍条组织细胞系可用于新加坡石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus，SGIV）的研究[19]。脑组织细胞系可用于鲤疱疹病毒二型（Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2）的研究[26]；脾脏组织细胞系可用于石斑鱼虹彩病毒（grouper iridovirus,GIV）和鳜传染性脾肾坏死病毒（infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV）的增殖研究[62]。目前使用细胞系鉴定的病毒有至少有30 种，包括呼肠孤病毒科、双RNA 病毒科、正黏病毒科、副黏病毒科、杯状病毒科、疱疫病毒科、小RNA 病毒科和虹彩病毒科等[20]。

似乎鱼类细胞系仅能用于鱼类病毒的研究，其实鱼类细胞系还可以用于来自两栖动物蛙病毒属病毒的研究[69]。当然，鱼类细胞系是否能用于感染其他水生动物病毒的研究还有待进一步研究。

细胞系除了可以分离病毒外，还可以通过细胞培养研究鱼类病毒致病机制，可以从源头上了解病毒的感染过程，解决水生动物疫病预防中“卡脖子”问题，促进水产养殖业可持续发展。

6 存在问题和建议

目前，虽然鱼类细胞培养已经取得了许多成果，但是仍然存在许多尚未解决的问题，值得深入研究。

（1）传代稳定性问题。正常细胞的分裂次数有限，这是遗传因素所决定，不易改变。因此，从正常组织获得的细胞系经过一定次数的分裂后，就会细胞衰老，要防止过度传代。此外也要注意细胞系传代过程中细胞突变现象，即细胞在培养初期鉴定过的形态、功能等，随着代数增加表现出现不再一致的现象。

（2）缺乏针对新发病毒病病原敏感细胞系的问题。鱼类细胞系在研究病毒中有许多优点，但是，单个鱼类细胞系并不适用于所有病毒增殖。如金鱼肾脏细胞系对CyHV-2 不敏感，不能用于CyHV-2 增殖[37]。鲈的鳍条细胞系不能用来增殖病毒性神经坏死病毒（viral nervous necrosis virus，VNNV）[70]。鱼类病毒的易感性具有物种特异性，而来自同种鱼的不同组织的细胞系对病毒敏感性也具有特异性。因此，为了适应日益增长的病毒种类，需要建立丰富的鱼类细胞系资源库。

（3）国内缺少鱼类细胞系数据库：国内细胞系报道很多，但多数研究没有跟进，即这些研究的可靠性尚未有足够的证实。建立一种细胞数据库，通过细胞系数据库及时更新细胞系相关信息，有助于及时了解鱼类细胞系的溯源情况和研究进展。

（4）缺少鱼类细胞系的国内流通机构。如在鲤疱疹病毒II 型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）敏感细胞系研究中，魏钰娟等[68]在异育银鲫脊髓组织细胞系的建立中，虽然已有学者建立了异育银鲫脑组织细胞系[33]和鳍条细胞系[9]，且研究CyHV-2 敏感性,但由于不对外供应,其限制了对CyHV-2 的研究。锦鲤组织细胞系[10,21]的研究也存在同样的问题。此外，ATCC 相关机构虽然可以购买一定的细胞系，但是某些客观原因，细胞系不能及时到达实验室；且国内学者构建部分细胞系不在ATCC 等机构保藏。因此，应建立细胞系的国内流通机构，保障对鱼类相关疾病的研究，从也避免相关研究机构花费大量人力、物力和资金建系。