高氧水和戊己丸对幽门螺杆菌的抑菌作用研究*

施 敏，刘富林，张叔琦，许文娟，夏旭婷，张 婷，李镕伟

（湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

幽门螺旋菌（Helicobacter pylori，Hp）是一种微需氧细菌，主要形态为螺旋弯曲，多定植在人体胃黏膜上皮表面和黏液底层[1]。因高感染率、高危害性，Hp广受临床工作者及科研工作者的关注。Hp在全球均具有高感染率[2]，我国Hp的感染率为41.35%～72.30%[3]。Hp有较强致病性，与慢性胃炎、消化性溃疡等一系列消化系统疾患的发生密切相关[4]。研究发现Hp与神经系统疾病、癌症、糖尿病等疾病也有一定相关性[5-7]。目前西医治疗Hp感染存在耐药性强、副作用明显、患者依从性差等问题[8]，而中医药辨证治疗Hp感染具有安全有效、可提高根除率等优势[9-10]。

高氧水是将无菌饮用水进行光化学容氧所得。高氧水的氧分压从21kPa升高至100～120kPa，氧含量从4.6%提高至14.6%，且常温常压下氧气不易逸出[11]。基于高氧环境对微需氧菌和厌氧菌的抑制作用，有学者提出高氧水或许可替代抗生素，开辟厌氧/微需氧菌感染治疗新途径的猜想[12]。车蕾等[13]将高氧水运用于厌氧菌的抑制研究，结果显示高氧水对异链球菌、中间普氏菌、黏性放线菌3种厌氧菌均具有抑菌作用。由此推测，高氧水对Hp亦应具有抑菌作用。

戊己丸由黄连、吴茱萸和白芍组成，临床研究发现超微戊己丸对Hp清除率为66.7%[14]。唐小梅等[15]运用戊己丸水煎液对Hp进行体外抑菌研究，结果显示戊己丸对Hp具有抑制作用。戊己丸能显著调节Hp感染胃炎小鼠胃内微生物及酶活性.[16]。《古今录验养生必用方》的戊己丸是黄连、吴茱萸、白芍按照1∶1∶1的质量配比[17]。2020年版《中华人民共和国药典》所载戊己丸中黄连、吴茱萸、白芍的药物质量配比为6∶1∶6[18]。

本研究基于高氧水可破坏Hp的生存环境和戊己丸能抑制Hp生长的理论，运用体外抑菌实验论证高氧水抑制Hp的可行性，并比较古方戊己丸和药典戊己丸在抑制Hp方面的优劣，再选用效果更好的戊己丸以检验高氧水和戊己丸对Hp的抑制作用，旨在探索更安全、有效、廉价的治疗Hp感染的手段。

1 材料

1.1 菌株、药物 （1）细菌：H.pylori（批号：ATCC43504）购自广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC）。（2）药物：黄连超微颗粒40 g（批号：20010）、吴茱萸超微颗粒15 g（批号：200779）、白芍超微颗粒40 g（批号：191014）均购自湖南春光九汇现代中药有限公司，经湖南中医药大学张裕民主任药师鉴定合格。阿莫西林钠克拉维酸钾粉针剂（0.6 g/剂，批号：H10910017）购自华北制药有限公司。

1.2 试剂 胎牛血清（批号：10270106）、1640细胞培养基（批号：C1187500BT）均购自gibco公司；布氏琼脂培养基（批号：HB0315）购自青岛海博生物技术有限公司；无菌脱纤维绵羊血（批号：BJLY10031）购自南京便诊生物科技有限公司；高氧水由浙江氧典饮品有限公司提供，生产许可证号：SC10633102401450。

1.3 主要仪器 MIS型高温高压灭菌锅（施都凯仪器设备有限公司）；GNP-9270型恒温恒湿培养箱（上海三发科学仪器有限公司）；TG16-WS型离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；DK-98-IIA型水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）。

2 方法

2.1 各试剂对Hp的抑菌活性测定及比较

2.1.1 药物制备 （1）古方戊己丸：取黄连、吴茱萸、白芍超微颗粒剂各10 g分别置于试管中加蒸馏水30 mL搅拌使之充分溶解，4 ℃，4 000 r/min离心10 min（离心半径为8 cm）吸取上清液，混合置于1个大试管再按上述条件离心10 min，吸取离心后的上清液得到戊己丸药液。（2）药典戊己丸：取黄连30 g、吴茱萸5 g、白芍30 g超微颗粒剂，制备方法同古方戊己丸。（3）高氧戊己汤：于无菌环境下吸取制备好的古方戊己丸药液5 mL，再吸取5 mL高氧水置于无菌试管中，得到10 mL高氧戊己汤。（4）抗生素药液制备：吸取蒸馏水5 mL注入阿莫西林钠克拉维酸钾粉针剂瓶中，摇晃瓶身使之溶解，加入10 mL生理盐水稀释至每1 mL药液含有阿莫西林10 μg的试剂。

2.1.2 布氏琼脂培养皿制备 称取布氏琼脂培养基粉8.62 g置于椎型瓶中加入200 mL蒸馏水，加热搅拌溶解后于120 ℃高压灭菌15 min。取一个90 mL玻璃平皿，倒入约20 mL蒸馏，标记液面水平。比照已经标记好的平皿，将加入无菌脱纤维绵羊血的布氏液体琼脂倒入90 mL平皿，高度与标记线平齐。待制备好的布氏琼脂培养皿琼脂凝固后，密封放入恒温恒湿培养箱中鉴定培养24 h，无杂菌生长则为可用。

2.1.3 菌株成活及分裂培养 抽取菌株液0.5 mL注入于含有1640细胞培养基和灭活后胎牛血清的无菌真空采血管中，使试管内形成微需氧环境，封口并贴标签。置于微需氧密封箱中，放入微需氧产气袋后将微需氧密封箱加盖密封，放入37 ℃的恒温恒湿培养箱48 h。采血管内液体颜色变淡，采血管底部灰白色沉淀产生，且采血管内液体变浑浊提示菌株成活。

2.1.4 Hp菌液的制备 将复活菌株的采血管放入离心机中，4 ℃，4 000 r/min离心10 min（离心半径为8 cm），使Hp菌落置底，于无菌环境下吸取采血管底部含有Hp菌落的液体加入1640细胞培养基，再用0.5麦氏比浊管进行比浊，使菌液浓度达到1.5×108个/mL。

2.1.5 抑菌圈实验 （1）取灭菌后直径为6 mm的圆形纸片，分别于戊己丸药液、生理盐水、抗生素药液中浸湿后，于37 ℃恒温恒湿培养箱中4 h制备成含相应试剂的干燥药敏纸片，高氧水纸片选择含高氧水湿纸片。（2）将制备好的布氏琼脂培养皿均匀分为A、B、C、D、E区，分别代表古方戊己丸、药典戊己丸、高氧水、生理盐水和抗生素药液。（3）将Hp菌液0.1 mL均匀涂布在布氏琼脂培养皿上，取制备好的药敏纸片平贴于布氏琼脂培养皿对应的位置。（4）将贴好药敏纸片的布氏琼脂培养皿置于微需氧密封箱中，放入微需氧产气袋后将微需氧密封箱加盖密封，放入37 ℃恒温恒湿培养箱培养48 h后取出布氏琼脂培养皿，观察抑菌圈并用游标卡尺测量抑菌圈直径。

2.2 各试剂对Hp的MIC及MBC测定 通过“2.1.5”中抑菌圈实验结果选取抑菌效果更好的戊己丸，进行对Hp的MIC及MBC测定。（1）取6×8的48孔一次性无菌细胞培养板，各行由上到下依次标注为A、B、C、D，其中A、B、C分别代表戊己丸组、高氧戊己汤组、高氧水组；D行无指代，作为对照用。将每一列从左到右依此标注为“1”“2”“3”“4”“5”“6”“7”“8”。（见图1）

图1 细胞培养板

（2）向无菌48孔细胞培养板前3行和D1、D2各孔注入100 μL 1640细胞培养基。

（3）抽吸制备好的每1 mL含药1 000 mg的戊己丸药液，注入A1～A8孔中，使A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8各孔含戊己丸药液质量浓度应依次为500.000 00、250.000 00、125.000 00、62.500 00、31.250 00、15.625 00、7.812 50、3.906 25 mg/mL。同样方法在B行各孔中注入稀释高氧戊己汤，在C行各孔中注入稀释的高氧水。

（4）D3孔中注入100 μL每1 mL含药1 000 mg的戊己丸药液，D4孔中注入100 μL每1 mL含药1 000 mg的高氧戊己汤药液，D5孔中注入100 μL每1 mL含药1 000 mg的高氧水。

（5）分别向细胞培养板前3行和D1、D2各孔注入10 μL胎牛血清和10 μL制备好的菌液。

（6）将48孔细胞培养板用封口膜封口，置于微需氧密封箱中，将微需氧密封箱放入37 ℃恒温恒湿培养箱培养48 h。

（7）微需氧环境恒温恒湿培养48 h后将48孔细胞培养板取出，于灯下肉眼观察，无菌落生成、无试剂变色或变浑浊者为该药的MIC。

（8）运用点试法测定各药对Hp的MBC，于无菌环境下取制备好的90 mL含无菌脱纤维绵羊血的布氏琼脂培养皿3个，将每个平均分为12个扇形区域，并用马克笔依次标记为A1、A2、A3······D5。（见图2）

图2 琼脂培养皿

（9）将48孔细胞培养板各孔接种到划分好的90 mL含无菌脱纤维绵羊血布氏琼脂培养皿对应的区域上，接种完毕后，置于微需氧密封箱中，放入37 ℃恒温恒湿培养箱培养48 h，取出观察各区域是否有菌落生长，其中完全无菌落生长的最小浓度即为该药的MBC。

2.3 统计学方法 采用SPSS 25.0软件处理。计量资料以“均数±标准差”（±s）表示,满足正态性和方差齐性的计量资料采用多样本单因素方差分析，各组间两两比较使用LSD法；不符合正态性者采用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 抑菌圈实验（纸片琼脂扩散法）结果 高氧水、古方戊己丸、药典戊己丸、抗生素的抑菌圈直径均大于生理盐水（P＜0.05或P＜0.01），且古方戊己丸的抑菌圈直径大于药典戊己丸（P＜0.01）。（见表1、图3）

表1 各药物抑菌圈直径比较 （±s，mm）

表1 各药物抑菌圈直径比较 （±s，mm）

注：与生理盐水比较，aP＜0.01，bP＜0.05；与典戊己丸比较，cP＜0.01。

药物n抑菌圈生理盐水36.7±0.0药典戊己丸316.5±0.8b古方戊己丸325.4±0.7ac高氧水312.2±0.8b抗生素314.5±0.4a F 332.572 P 0.000

图3 纸片琼脂扩散法测定各试剂的抑菌圈

3.2 各药物对Hp的MIC及MBC测定 灯下肉眼观测各培养孔细菌的生长情况，A组和B组未见菌落生长的最后一个菌孔均为5号孔；C组未见菌落生长的最后一个菌孔为4号孔；D组为对照组，除2号孔外，其余菌孔均未见菌落生长。（见表2）

表2 肉眼观测各孔Hp的生长情况

运用点试法测定各培养孔细菌的存活性，A组和B组试剂未见菌落生长的最后一个菌孔均为4号孔；C组未见菌落生长的最后一个菌孔为2号孔；D组为对照组，除2号孔外，其余菌孔均未见菌落生长。（见表3）

表3 点试法测定各孔Hp的生长情况

对照组2发现菌落生长，对照组1、3、4、5未发现菌落成长。（见表4）

表4 各对照组Hp菌落的生长情况及意义

古方戊己丸对Hp的MIC为31.25 mg/mL，MBC为62.50 mg/mL；高氧水对Hp的MIC为62.50 mg/mL，MBC为250.00 mg/mL；高氧戊己汤MIC对Hp的为31.25 mg/mL，MBC为62.50 mg/mL。（见表5）

表5 各药物组对Hp的MIC、MBC （mg/mL）

4 讨论

Hp感染具有高感染率、高致病性特点，根除Hp已成为胃炎、消化性溃疡、胃癌、消化不良等患病人群的首要治疗方案。但抗Hp的临床实践存在Hp高耐药性和彻底根除的矛盾性的问题。随着Hp抑菌药物的使用，关于Hp耐药性的报道逐年增多。以克拉霉素为例，其在日本和意大利的耐药比率高达30%，中国为50%，土耳其为40%，且其他抗生素也显示出相似的趋势[19-23]。临床工作中，根除Hp存在矛盾和争议。如肝肾功能不全或者对抗生素广泛过敏的Hp感染者如何彻底根除Hp？此外，依从性较差的患者难以规范使用四联疗法，或者反复根除Hp后再感染，已经形成明显耐药的Hp感染者，是否继续使用四联疗法根除Hp？因此，开发出一种更安全有效的方法防治Hp感染已迫在眉睫。针对这一现实需求，本研究团队结合中医药特色，进行了积极探索。

Hp感染在中医学中没有相对应的病名，历代医家根据其临床症状将其归为“胃脘痛”“反酸”“嘈杂”“痞满”等范畴。中医证候主要以脾胃湿热、肝胃不和及脾胃虚弱为主[24]。治疗主要以清热利湿、疏肝理气、活血化瘀、清热解毒、和胃止痛、健脾和胃、辛开苦降等立法[25]。《古今录验养生必用方》[26]记载戊己丸由黄连、吴茱萸、白芍按照1∶1∶1的质量配比。方中黄连为君药，清肝胃之热；白芍为臣药，和里止痛；吴茱萸为佐药，其辛助开郁，其热制黄连之苦寒。全方辛开苦降，肝胃同治，用以治疗肝火犯胃、肝胃不和所致的胃脘灼热疼痛、口苦嘈杂、呕吐吞酸、腹痛泄泻。

本研究的抑菌圈实验发现《古今录验养生必用方》记载的戊己丸抑菌效果优于药典戊己丸，原因可能是古方戊己丸中黄连和吴茱萸以1∶1质量配伍，平调寒热，适用证型广，而药典戊己丸中黄连和吴茱萸以6∶1质量配伍，方性寒重于温，适用证型较为局限。

本研究通过抑菌圈实验和各药物对Hp的MIC及MBC测定发现高氧水对Hp有一定的抑菌活性，其作用机理可能与高氧水可以破坏Hp的微需氧生存环境有关。高氧水是食品级商品，对人体的毒副作用相对较小，暂未发现有关于高氧水的过敏和不良反应报道。因此，本研究论证的高氧水可抑制Hp假说具有临床意义，使不服用药物即可杀灭Hp成为可能，同时为肝肾功能不全的Hp患者、对抗生素过敏的Hp患者、不能耐受四联疗法的Hp患者、未见临床症状的Hp感染者提供了安全可行的抗Hp手段。戊己丸水煎液对Hp也有抑杀作用，这与诸多学者的[14-16]研究结果一致，

实验结果显示高氧戊己汤对Hp的抑菌作用未明显优于戊己丸单独使用，分析原因如下。其一，中药在人体中对Hp的抑制作用有两种方式：与Hp直接接触抑杀细菌以及通过介导人体的免疫细胞抑杀细菌。本研究为体外抑菌，未在活体中进行，故无法介导人体的免疫细胞，故未形成协同抑菌的结果。其二，高氧水与戊己丸1∶1质量配比时，中药药液稀释了高氧水，使高氧戊己汤每毫升含氧量不足以破坏Hp的生存环境，故高氧戊己汤对Hp的抑杀作用主要依靠药液中的中药成分。

后续研究将考虑中药汤剂与高氧水配比，设置不同浓度中药与高氧水配比的比较研究，寻找最强的抑菌配比，以此为后续的动物实验及临床研究提供基础数据。

综上所述，戊己丸和高氧水对Hp均有抑制作用，为中医药临床防治Hp感染提供了防治思路和实验依据。