产反式肉桂酸内生真菌GRE4的鉴定及发酵条件研究

张赫 关昕 祁可香 尤梦瑶 郑春英

摘要：采用HPLC法，以反式肉桂酸为对照，分析内生真菌GRE4的活性成分；采用琼脂糖扩散法，对内生真菌GRE4进行抑菌活性分析，并采用单因素实验及正交实验对内生真菌GRE4的发酵条件进行优化；采用形态学观察及ITS序列分析法，对内生真菌GRE4进行初步菌种鉴定。结果表明，在内生真菌GRE4发酵液中含有反式肉桂酸；抑菌活性实验结果表明，内生真菌对10种致病菌均有较好的抑制作用，尤其对铜绿假单胞菌的抑菌效果较显著；优化后得到GRE4的最佳发酵工艺条件：培养基碳源为质量浓度2.0%的葡萄糖，氮源为质量浓度1.5%的蛋白胨，初始pH值为7.0，装液量为50%（体积比），种子液接种量为5%（体积比），空气浴振荡器仪器参数为140 r/min、28 ℃培养9 d。经鉴定，内生真菌GRE4为杂色曲霉（Aspergillus versicolor）。上述研究说明内生真菌GRE4为反式肉桂酸产生菌。

关键词：反式肉桂酸；内生真菌；抑菌活性；发酵条件；鉴定

中图分类号：TS201.2      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）07-0025-07

Abstract： The active components of endophytic fungus GRE4 are analyzed by HPLC method with trans-cinnamic acid as the control. The agarose diffusion method is used to analyze the antibacterial activities of endophytic fungus GRE4 and the fermentation conditions of endophytic fungus GRE4 are optimized by single factor experiment and orthogonal experiment. Morphological observation and ITS sequence analysis method are used to preliminarily identify the endophytic fungus GRE4. The results show that there is trans-cinnamic acid in the endophytic fungus GRE4 fermentation broth.The antibacterial activity results show that endophytic fungus has good antibacterial effects on 10 pathogenic bacteria， especially on Pseudomonas aeruginosa. After optimization， the optimum fermentation process conditions of GRE4 are determined as follows： the carbon source of the culture medium is glucose with the mass concentration of 2.0%， and the nitrogen source is peptone with the mass concentration of 1.5%， the initial pH value is 7.0， the liquid volume is 50%（volume ratio）， the inoculation amount of seed liquid is 5% （volume ratio）， the instrument parameters of air bath oscillator are 140 r/min， 28 ℃ and the incubation time of 9 d. Through identification， endophytic fungus GRE4 is Aspergillus versicolor. The results indicate that endophytic fungus GRE4 is a trans-cinnamic acid-producing fungus.

Key words： trans-cinnamic acid； endophytic fungus； antibacterial activity； fermentation condition； identification

反式肉桂酸（見图1）是一种重要的有机酸[1]，具有抑菌[2]、抗氧化[3]、抗炎[4]等活性，安全、无毒，既可用于配制香辛料，也可作为水果防腐保鲜剂[5]，既是重要的有机合成工业中间体，用以合成人体自身不能合成的必需氨基酸——L-苯丙氨酸[6]。现在反式肉桂酸的生产方法主要为化学合成[7]，但反式肉桂酸在合成过程中存在工艺流程长、反应条件苛刻等问题[8]。从植物中提取反式肉桂酸存在得率低、浪费植物资源等问题[9]。

植物内生菌是一类寄生在植物组织中，并且不会导致宿主植物发生病变的微生物[10]。植物内生菌作为重要的微生物资源[11]，具有能够产生多种次生代谢产物的特点[12]。从植物内生菌所产生的次生代谢物中筛选出天然活性物质，并利用微生物发酵法生产其次生代谢产物[13]，可节省资源[14]，并应用于医药、食品以及调味品生产中，这对生产新型功能性调味品具有重要意义。

甘草是一种常见的甜味剂[15]，其主要甜味成分是甘草甜素，具有抗病毒、抗氧化、解毒以及免疫调节等多种活性作用[16]。甘草常作为功能性调味品应用于食品加工中。而甘草内生菌能够产生与甘草相同或相似的次生代谢产物[17]，并具有较好的生物活性。因此，采用微生物发酵法，从甘草植物体内分离出的内生菌中寻找能够产生作为调味品及香料成分的内生菌[18]，通过发酵生产其目的次生代谢产物[19]已成为当前调味品生产的发展方向。

本文以内生真菌GRE4为研究对象，以反式肉桂酸为指标，对GRE4发酵后获得的次生代谢产物进行分析，同时进行抑菌实验，分析其抑菌活性，对GRE4发酵工艺条件进行优化，并对GRE4进行菌种鉴定，确定其种属关系，以期为采用微生物发酵法生产反式肉桂酸原料提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试菌株：GRE4分离自甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）根部（野生健康乌拉尔甘草，采集自黑龙江省大庆地区）；参阅文献[20-21]配制营养琼脂培养基（NA）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）及马铃薯液体培养（PDB）；通用引物ITS1、ITS4（参阅文献[22]，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成）；枯草芽孢杆菌等11株用于抑菌活性实验的受试菌（购于黑龙江省微生物研究所）；HPLC分析所用试剂为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HZQ-C型空气浴振荡器 哈尔滨市东明医疗仪器厂；DL-CJ-ZN医用型洁净工作台 北京东联哈尔滨仪器制造有限公司；DK-S26型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；KQ-100DE型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；FL2200型高效液相色谱仪、FL2200型紫外检测器 温岭市福立分析仪器有限公司；Venusil XBP-C 18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） Agela Technologies Inc.。

1.3 方法

1.3.1 内生真菌GRE4发酵液的制备

参阅文献[23]，在无菌条件下，向适量无菌水中加入已活化的内生真菌GRE4，制备成 1×107 CFU/mL的种子液；再以5%（体积比）的接种量，于50 mL PDA培养基中接种制备好的GRE4种子液，并将其置于空气浴振荡器中培养9 d（空气浴振荡器仪器参数：28 ℃，140 r/min）后，滤除菌丝体，取发酵液备用。

1.3.2 甘草内生真菌GRE4发酵液次生代谢产物分析

参阅文献[24]，采用HPLC法。流动相：乙腈∶水∶冰醋酸为30∶70∶0.1%；柱温为25 ℃；流速为1 mL/min；检测波长为254 nm；进样量为10 μL。

1.3.2.1 供试品溶液的制备

取100 mL“1.3.1”中的发酵液，采用乙醚萃取2次（2×100 mL），合并萃取液，回收萃取液（50 ℃，0.1 MPa）后，残渣加1 mL色谱级甲醇，超声使残渣全部溶解，并以0.22 μm微孔滤膜过滤后，作为供试品溶液，备用。

1.3.2.2 对照品溶液的制备

取0.5 mg反式肉桂酸对照品，精密称定，加1 mL色谱级甲醇使其溶解，作为对照品溶液，备用。

1.3.2.3 空白对照品溶液的制备

方法同“1.3.2.1”，取100 mL PDB培養基，制成空白对照品溶液，备用。

1.3.2.4 样品分析

分别取10 μL“1.3.2.1”、“1.3.2.2”和“1.3.2.3”中的供试品溶液、对照品溶液及空白对照品溶液，进行HPLC分析。

1.3.3 甘草内生真菌GRE4抑菌活性的测定

取500 mL“1.3.1”中的发酵液，将发酵液进行冻干处理，称取所得冻干粉适量，将适量甲醇加入至称好的冻干粉中，使其溶解，制成浓度为0.1 mg/mL的甲醇提取物作为抑菌活性测定供试品；阳性对照品为链霉素和制霉素（质量浓度均为100 μg/mL）；选取甲醇溶液为空白对照，参阅文献[25]，采用琼脂糖法进行抑菌活性测定。

1.3.4 甘草内生真菌GRE4发酵条件筛选

1.3.4.1 单因素实验

a.甘草内生真菌GRE4接种量对其抑菌活性的影响

取“1.3.1”中制备的种子液，分别按不同的接种量3%、4%、5%、6%、7%、8%（体积比）接种到PDB培养基（50 mL，初始pH为7.0）中，置于空气浴振荡器（仪器参数：28 ℃，140 r/min）中，发酵培养9 d后，取出，采用“1.3.3”方法测定内生真菌GRE4发酵液对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的抑菌活性（n=3）。

b.培养基装液量对甘草内生真菌GRE4抑菌活性的影响

取“1.3.1”中制备的种子液，以5%（体积比）的接种量，将种子液分别接种到含有不同装液量的PDB培养基中，装液量依次为20，30，40，50，60，70 mL，初始pH为7.0，发酵培养9 d后，取出，其他操作同“1.3.4.1”中a。

c.培养基初始pH值对甘草内生真菌抑菌活性的影响

取“1.3.1”中制备的种子液，以5%（体积比）的接种量，将种子液分别接种到不同初始pH值的PDB培养基（50 mL，初始pH值依次为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）中，发酵培养9 d后，取出，其他操作同“1.3.4.1”中a。

d.甘草内生真菌GRE4发酵时间对其抑菌活性的影响

取“1.3.1”中制备的种子液，以5%（体积比）的接种量，将种子液接种到PDB培养基（50 mL，初始pH为7.0）中，置于空气浴振荡器（仪器参数：28 ℃，140 r/min）中，发酵培养5，7，9，11，13，15 d，其他操作同“1.3.4.1”中a。

e.仪器参数对甘草内生真菌GRE4抑菌活性的影响

取“1.3.1”中制备的种子液，以5%（体积比）的接种量，将种子液接种到PDB培养基（50 mL，初始pH为7.0）中，置于空气浴振荡器中，空气浴振荡器转数分别设定为100，120，140，160，180，200 r/min；温度分别设定为22，24，26，28，30，32 ℃，发酵培养9 d后，取出，其他操作同“1.3.4.1”中a。

f.培养基碳源及其质量浓度对甘草内生真菌GRE4抑菌活性的影响

分别选用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖为培养基中的碳源、以0%、1%、2%、3%、4%、5%（质量和体积比）的质量浓度制备“1.1”中的PDB培养基，并以5%（体积比）的接种量，将“1.3.1”中制备的种子液接种到初始pH为7.0的培养基（50 mL）中，置于空气浴振荡器（仪器参数：28 ℃，140 r/min）中，发酵培养9 d，取出，其他操作同“1.3.4.1”中a。观察并分析不同碳源在不同质量浓度下对内生真菌GRE4抑菌活性的影响（n=3）。

g.培养基氮源及其质量浓度对甘草内生真菌GRE4抑菌活性的影响

分别选用牛肉膏、酵母膏、蛋白胨为培养基中的氮源，以0%、0.5%、1%、1.5%、2%（质量和体积比）的质量浓度制备“1.1”中的PDB培养基，同“1.3.4.1”中f的其他条件，发酵培养9 d后，取出。观察并分析不同氮源在不同质量浓度下对内生真菌GRE4抑菌活性的影响（n=3）。

1.3.4.2 正交实验

基于“1.3.4.1”单因素实验筛选结果，分别选取碳源浓度、氮源浓度、初始pH值和发酵时间4个因素，采用L 9（34）正交实验设计发酵条件，见表1。

1.3.5 甘草内生真菌GRE4的鉴定

参阅文献[26]，采用显微观察法观察 GRE4菌落形态；同时，采用扦片法观察GRE4的孢子形态，初步确定菌株的分类地位[27]。

ITS序列分析：参阅文献[28]对内生真菌GRE4菌株的DNA进行提取，对PCR所获得的产物进行纯化，委托生工生物工程（上海）股份有限公司對所获得的纯化后的PCR产物完成测序工作。将测序所得到的序列提交NCBI数据库，经Blast检索分析，选取同源性较高的序列进行对比检测，利用MEGA 7软件构建系统发育树，通过分析系统发育树，明确内生真菌GRE4的种属关系。

2 结果与分析

2.1 甘草内生真菌GRE4发酵液活性成分分析结果

以反式肉桂酸作为对照，采用HPLC法对内生真菌GRE4发酵液活性成分进行分析，结果见图2。

由图2可知，在保留时间9.80 min时，内生真菌GRE4发酵液及反式肉桂酸对照品均出现相同的色谱峰，而空白对照品（PDB培养基）在该保留时间无相应的色谱峰出现，说明内生真菌GRE4发酵液中含有反式肉桂酸，内生真菌GRE4为反式肉桂酸产生菌。

2.2 甘草内生真菌GRE4抑菌活性测定结果

采用琼脂糖法进行抑菌活性测定，GRE4发酵液抑菌活性测定结果见表2。

由表2可知，内生真菌GRE4对10株致病细菌均能够产生一定的抑制作用，其中对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的抑制作用最强。

2.3 内生真菌GRE4发酵条件优化筛选结果

2.3.1 单因素实验结果

2.3.1.1 甘草内生真菌GRE4接种量对其抑菌活性的影响结果

内生真菌GRE4发酵液在不同接种量条件下的抑菌活性结果见图3。

由图3可知，当内生真菌GRE4接种量为5%时，其抑菌活性最强；当接种量＞5%时，单位容积培养基内菌株密度增加，导致菌株生长空间过少，从而不利于菌株的正常生长发育，进而使抑菌活性产物的合成减少。

2.3.1.2 培养基装液量对甘草内生真菌GRE4抑菌活性的影响结果

在不同培养基装液量条件下，内生真菌GRE4的抑菌活性结果见图4。

由图4可知，随着装液量的增加，GRE4的抑菌活性出现先增强后减弱的趋势，当装液量为50%（体积比）时，GRE4的抑菌活性最强。出现这种现象的原因可能是过度增加装液量，在抑菌活性产物总量不变或变化程度比装液量变化程度小时，导致单位体积内抑菌活性产物变少，使其浓度被稀释，从而导致抑菌活性的强度减弱。

2.3.1.3 培养基初始pH值对甘草内生真菌GRE4抑菌活性的影响结果

在不同培养基初始pH值条件下，内生真菌GRE4的抑菌活性结果见图5。

由图5可知，培养基初始pH值对GRE4的抑菌活性具有一定的影响，当发酵液初始pH值≤7.0时，随着pH的逐渐提高，GRE4的抑菌活性逐渐增强；当初始pH值控制为7.0时，GRE4发酵液的抑菌活性最强值，其抑菌圈直径可达（24.71±0.24） mm。当发酵液初始pH值>7.0时，随着pH的逐渐提高，GRE4的抑菌活性逐渐被抑制并出现减弱的趋势。由此可见，GRE4发酵液最适初始pH为7.0。

2.3.1.4 甘草内生真菌GRE4发酵时间对其抑菌活性的影响结果

不同发酵时间下，内生真菌GRE4发酵液的抑菌活性结果见图6。

由图6可知，在不同发酵时间下，GRE4的抑菌活性不同。具体表现为随着发酵时间的增加，抑菌活性呈现先增强后减弱的趋势。当发酵时间为9 d时，内生真菌GRE4的抑菌活性最强，此后，随着发酵时间的延长，其抑菌活性出现逐渐减弱的趋势。这可能是由于GRE4菌株在不同生长期，其次生代谢产物产量及种类有所不同。

2.3.1.5 仪器参数对甘草内生真菌GRE4抑菌活性的影响结果

设置不同的空气浴振荡器仪器参数，观察内生真菌GRE4发酵液的抑菌活性，结果见图7和图8。

由图7和图8可知，选择空气浴振荡器转速及温度两个参数，观察其对内生真菌GRE4发酵液抑菌活性的作用。结果表明，仪器参数不同，GRE4抑菌活性不同。当设置空气浴振荡器转速为140 r/min、温度为28 ℃时，其抑菌活性最强。

2.3.1.6 培养基碳源及其质量浓度对甘草内生真菌GRE4抑菌活性的影响结果

在培養基碳源种类不同及其质量浓度不同的条件下，甘草内生真菌GRE4发酵液的抑菌活性测定结果见图9。

由图9可知，培养基碳源及其质量浓度对内生真菌GRE4的抑菌活性有较大的影响，当2%葡萄糖作为培养基碳源时，内在真菌GRE4菌株的抑菌活性最强。

2.3.1.7 培养基氮源及其质量浓度对甘草内生真菌GRE4抑菌活性的影响结果

在培养基氮源种类不同及其质量浓度不同的条件下，内生真菌GRE4发酵液的抑菌活性结果见图10。

由图10可知，培养基氮源的选择及质量浓度对内生真菌GRE4的抑菌活性有一定的影响，当1%蛋白胨作为氮源时，内生真菌GRE4发酵液的抑菌活性最强。

2.3.2 正交实验结果

正交实验结果见表3，方差分析结果见表4。

结合表3和表4可知，能够对GRE4的抑菌活性起到影响作用的因素顺序为碳源质量浓度>氮源质量浓度>初始pH值>发酵时间。对GRE4抑菌活性产生影响的因素如下：碳源及其质量浓度的影响极显著；氮源及其质量浓度的影响显著；培养基初始pH值的影响显著；GRE4发酵时间无显著影响。由此可知，GRE4的最优发酵条件为A 2B 3C 2D 2，即选择质量浓度3%的葡萄糖作为培养基碳源，选择质量浓度1.5%的蛋白胨作为培养基氮源，培养基初始pH值7.0，发酵培养9 d。综合单因素实验、正交实验及方差分析的结果，确定GRE4的最佳发酵条件：质量浓度为3%的葡萄糖，质量浓度为1.5%的蛋白胨，装液量为50%（体积比），接种量为5%（体积比），初始pH值为7.0，培养时间为9 d，空气浴振荡器转速为140 r/min，发酵温度为28 ℃。

分别采用最佳发酵条件及“1.3.1”项发酵条件对内生真菌GRE4进行发酵培养，取两种不同发酵条件培养后的发酵液进行抑菌实验，抑菌结果表明，在最佳发酵工艺条件下，内生真菌GRE4的抑菌圈直径为（22.3±0.22） mm，比未进行优化的发酵条件的抑菌圈直径提高1.30 mm。上述结果验证了最佳发酵条件的合理性。

2.4 内生真菌GRE4的鉴定结果

2.4.1 内生真菌GRE4形态学观察结果

在PDA 固体培养基上培养7 d后，甘草内生真菌GRE4的菌落直径为（13.00±0.30） mm左右。菌落呈现白色，渐变为灰绿色，基质呈现棕黄色。菌落为紧密圆形，绒毛状，颜色有数环，从灰绿到青绿，菌落边缘整齐，紧贴培养基，见图11中a。GRE4产分生孢子，分生孢子头的顶囊近似球形，呈放射状排列。GRE4的孢子形态见图11中b。

2.4.2 内生真菌GRE4 ITS序列分析结果

经PCR扩增后，从甘草内生真菌GRE4基因组DNA获得1条长度为500 bp的特异性条带，将获得的ITS序列提交到NCBI数据库，经GenBank分析后，运用MEGA 7分析与内生真菌GRE4序列同源性较高的菌株序列，建立内生真菌GRE4的系统发育树（见图12）。内生真菌 GRE4 序列（菌种登录号：OP614981）与曲霉属杂色曲霉（Aspergillus versicolor，JN545818.1）的相似性达到了100%，结合形态学观察结果将甘草内生真菌GRE4菌株鉴定为杂色曲霉（Aspergillus versicolor）。

3 结论

从甘草内生真菌中筛选得到一株反式肉桂酸的产生菌GRE4，GRE4的抑菌活性作用较强，为充分利用其生物活性，对其发酵工艺条件进行筛选，最终得出内生真菌GRE4的最佳发酵条件：培养基选择质量浓度3.0%的葡萄糖作为碳源，质量浓度1.5%的蛋白胨作为氮源，初始pH值为7.0，装液量为50%（体积比），接种量为5%（体积比），培养时间为9 d，空气浴振荡器仪器参数设置为转速140 r/min、温度28 ℃。该条件下，GRE4抑菌圈直径比未优化前提高了1.30 mm；经鉴定，内生真菌GRE4为杂色曲霉（Aspergillus versicolor）。杂色曲霉能产生多种次生代谢产物[29]，如喹诺酮类化合物[30]、萜类化合物[31]和哌嗪二酮类化合物[32]等，并具有抗菌[33]、抗氧化[34]和抗病毒[35]等多种生物活性，是有开发应用潜力的工业菌株[36]。上述结果为采用内生真菌GRE4发酵液生产反式肉桂酸原料提供了参考，为反式肉桂酸的生产开发提供了新途径。

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