顶空气相色谱法测定唑来膦酸中5种残留溶剂

陈默 于明 徐万魁

【摘要】目的：建立顶空气相色谱法测定唑来膦酸中残留溶剂甲醇、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯和氯苯的含量。方法：以含正丙醇的50%吡啶溶液为溶剂；正丙醇为内标；采用6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱；起始温度40℃，维持8分钟，以每分钟10℃的速率升温至200℃，维持5分钟；进样口温度200℃；检测器温度250℃；载气为氦气；顶空瓶平衡温度90℃，平衡时间20分钟。结果：在该色谱条件下5种待测溶剂分离度良好，在所考察的浓度范围内线性关系良好（r=0.9999）；各溶剂的回收率在92.3%～109.2%之间，RSD%（n=9）小于2.4%；重复性良好，RSD%（n=6）小于2.0%；方法耐用性良好。结论：该方法简便、灵敏、准确，适用于本品残留溶剂的测定。

【关键词】气相色谱法；唑来膦酸；甲醇；丙酮；异丙醇；乙酸乙酯；氯苯

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.01.032

Determination of Five Organic Solvent Residuesin Zoledronic Acid by Headspace Gas Chromatography

CHEN Mo，YU Ming，XU Wan-kui*

（Liaoning Institute for Drug Control，Shenyang 110036，China）

Abstract：Objective：To establish a headspace gas chromatography method for the determination of residual solvents such as methanol，acetone，isopropanol，ethyl acetate and chlorobenzene in zoledronic acid. Methods：Sample was dissolved in 50% pyridine solution with n-propanol，usingn-propanolastheinternalstandard. Capillarycolumnpackedwith6%cyanopropylphenyl-94% dimethylpolysiloxanewas used.The initial column temperature was kept at 40℃for 8 min with an increase rate of 10℃·min-1to 200℃and sustained for 5 min. The injector port temperature was 200℃and the FID temperature was 250℃. The carrier gas was Helium. The Vials was incubated at 90℃for 20 min. Results Thedetected solvents were separated completely. There was a good linear relationship within the investigated concentration range（r=0.9999）.The mean recoverieswere 92.3%～109.2%，with RSD%（n=9）being no more than 2.4%. The method has good precision and robustness. Conclusion：The method is simple，sensitive and accurate，which can be used for the determination of residual solvents in zoledronic acid.

Key words：headspace gas chromatography；zoledronic acid；methanol；acetone；isopropanol；ethyl acetate；chlorobenzene

唑來膦酸是咪唑杂环双膦酸盐，属于第三代双膦酸盐类药物，可抑制破骨细胞介导下的骨质代谢和吸收[1]，常见剂型为注射剂，临床上用于治疗恶性肿瘤溶骨性骨转移引起的骨痛和恶性肿瘤引起的高钙血症，也可治疗骨质疏松症。有机溶剂在药物合成反应中必不可少，在工艺过程中不能完全去除的有机溶剂超过一定安全值会给人体带来危害。

《中国药典》残留溶剂测定法[2]中将药品中常见残留溶剂分为三类，针对每一类有不同的限度要求。唑来膦酸合成中普遍使用氯苯，由于各企业合成工艺不同，使用的其他有机溶剂略有不同。本文采用顶空气相色谱法测定唑来膦酸中甲醇、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯和氯苯的残留量。

1仪器与试药

1.1仪器

岛津GC-2010Plus型气相色谱仪，AOC-5000 AUTO INJECTOR，氢火焰离子化检测器（FID）。METTLER XP 205型电子分析天平。

1.2试药

甲醇（天津康科德科技有限公司，批号210401，纯度≥99.90%），丙酮（国药集团化学试剂有限公司，批号20200608，纯度≥99.5%），异丙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号20190722，纯度≥99.7%），乙酸乙酯（国药集团化学试剂有限公司，批号20181107，纯度≥99.5%），氯苯（国药集团化学试剂有限公司，批号T20110429，纯度≥98.5%）。唑来膦酸样品（E企业，批号7ZOP419008、7ZOP419009、7ZOP419010）。吡啶（国药集团化学试剂有限公司，批号20160617，分析纯），正丙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号14100209，分析纯），实验用水为娃哈哈纯净水。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为DB-624（30 m×0.53 mm，3μm）；起始温度为40℃，维持8分钟，以每分钟10℃的速率升温至200℃，维持5分钟；进样口温度为200℃；检测器温度为250℃；载气为氦气，流速：4 mL/分钟；分流比5∶1；顶空瓶平衡温度为90℃，平衡时间为20分钟。

2.2溶液的制备

2.2.1内标溶液的制备

取正丙醇适量，用50%吡啶溶液稀释制成每1 mL中约含1 mg的溶液。

2.2.2供试品溶液的制备

取本品约0.2 g，精密称定，置10 mL顶空瓶中，精密加入内标溶液2 mL使溶解，密封。

2.2.3对照品溶液的制备

精密称取甲醇0.3198 g、丙酮0.5063 g、异丙醇0.4803 g、乙酸乙酯0.5185 g、氯苯0.04012 g，置20 mL量瓶，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液Ⅰ，精密量取对照品贮备液Ⅰ1 mL置50 mL量瓶中，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液Ⅱ，精密量取2 mL，置10 mL顶空瓶中，密封。

2.3方法学考察

2.3.1专属性试验

精密量取内标溶液2 mL，置10 mL顶空瓶中，密封，作为空白内标溶液；精密量取50%吡啶溶液2 mL，置10 mL顶空瓶中，密封。照“2.1”项下色谱条件试验，记录色谱图。可见，内标溶液对甲醇、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯和氯苯的检测无干扰，50%吡啶溶液对正丙醇（内标）色谱峰无干扰；丙酮峰与异丙醇峰的分离度、氯苯峰与相邻色谱峰的分离度分别为2.28、1.69，均满足能分离度要求（分离度不小于1.5）。见图1。

2.3.2线性关系考察

精密量取“2.2.3”中对照品贮备液Ⅰ0.5 mL、1 mL和2 mL，分别置50mL量瓶中，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液④⑤⑥。

精密量取线性溶液⑤0.25 mL、0.5 mL和5 mL，分别置50 mL量瓶中，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液①②③。

精密量取各线性溶液2 mL，分别置10 mL顶空瓶中，密封，照“2.1”项下色谱条件试验。

以对照品溶液中各待测溶剂浓度为横坐标，待测溶剂与内标溶剂峰面积的比值为纵坐标进行线性回归，各待测溶剂的线性范围、线性方程和相关系数见表1。

2.3.3检测限和定量限

精密量取线性溶液①2.5 mL、5 mL、6.5 mL和12.5 mL，分别置50 mL量瓶中，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，分别作为丙酮和乙酸乙酯检测限溶液（a），甲醇、异丙醇和氯苯检测限溶液（b），丙酮和乙酸乙酯定量限溶液（c），甲醇、异丙醇和氯苯定量限溶液（d）。

精密量取上述溶液各2 mL，分别置10 mL顶空瓶中，密封，摇匀。

照“2.1”项下色谱条件试验，记录色谱图，当S/N=2～3和S/N=10时，分别计算检测限和定量限，结果见表1。

2.3.4精密度试验

2.3.4.1系统精密度

精密量取“2.2.3”中对照品贮备液Ⅱ2 mL，置10 mL顶空瓶中，密封，同法制备6份。

照“2.1”项下色谱条件试验。甲醇、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯和氯苯峰面积与正丙醇峰面积比值的RSD%分别为1.10%、1.48%、0.93%、1.42%和1.79%。

2.3.4.2重复性试验

樣品约0.2 g，精密称定，置10 mL顶空瓶中，共6份，分别精密加入“2.3.2”中对照品贮备液Ⅱ2 mL，使溶解，密封，作为加标供试品溶液。

对照品溶液见“2.3.4.1”。照“2.1”项下色谱条件试验。6份加标供试品溶液中甲醇、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯和氯苯峰面积与正丙醇峰面积比值的RSD%分别1.53%、1.25%、1.22%、1.34%、2.03%，含量的RSD%分别为1.31%、1.04%、1.16%、1.19%、1.27%。

2.3.5准确度试验

精密量取“2.2.3”中对照品贮备液Ⅰ0.5 mL、1 mL和1.2 mL，分别置50 mL量瓶中，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，作为50%、100%、120%三个浓度水平混合对照品贮备液。取样品约0.2 g，精密称定，置10 mL顶空瓶中，共9份，分别精密加入三个浓度的混合对照品贮备液2 mL，使溶解，密封，各3份，作为供试品溶液。

精密量取“2.2.3”中对照品贮备液Ⅱ2 mL，置10 mL顶空瓶中，密封，作为对照品溶液。照“2.1”项下色谱条件试验，分别测定供试品溶液中待测溶剂含量，将测得量与样品中含量的差值与加入量比较，计算回收率。

结果，甲醇、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯和氯苯的回收率平均值分别为98.01%、108.18%、104.54%、109.25%和92.26%，RSD%（n=9）分别为1.89%、2.20%、2.36%、2.04%和1.67%。

2.3.6稳定性试验

50%吡啶溶液对唑来膦酸样品具有较好的溶解性，由于待测残留溶剂中有乙酸乙酯，而50%吡啶具有弱碱性，对乙酸乙酯有水解作用。

取对照品溶液2份，分别于0时和17时，照“2.1”项下色谱条件试验。0时和17时色谱图中f乙醇/f乙酸乙酯（%）的相对平均偏差为2.84%，结果表明17小时内对照品溶液稳定性良好。乙酸乙酯的水解反应主要发生在顶空气-液平衡过程中，温度高水解反应加快，但所用溶剂对乙酸乙酯的水解作用较弱，可忽略不计。

2.3.7色谱条件耐用性考察

本方法以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷（或极性相近）为固定液的毛细管柱为色谱柱，更换不同品牌或内径的色谱柱，并相应改变升温速率和柱流速进行测定。

①TG-624（30 m×0.53 mm，3μm），升温速率6℃·min-1，其他色谱条件不变：丙酮峰与异丙醇峰、氯苯峰与相邻色谱峰的分离度分别为1.86和1.67；

②DB-624UI（30 m×0.32 mm，1.8μm），流速2.30 mL·min-1，其他色谱条件不变：丙酮峰与异丙醇峰、氯苯峰与相邻色谱峰的分离度分别为1.89和2.82。

2.4样品测定

取三批唑来膦酸原料药，照“2.2”项下方法制备供试品溶液和对照品溶液，照“2.1”项下色谱条件测定。7ZOP419008批样品和7ZOP419009批样品中未检出甲醇、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯和氯苯，7ZOP419010批样品中未检出丙酮、乙酸乙酯和氯苯，检出甲醇和异丙醇，按内标法以峰面积比值计算，甲醇和异丙醇含量均为0.00046%，其中异丙醇残留量小于定量限。

3讨论

采用顶空气相色谱法测定残留溶剂时，首先应选择合适的溶剂溶解样品。唑来膦酸在水中微溶，在二甲基亚砜和N，N-二甲基甲酰胺等有机溶剂中几乎不溶。林生文[3]用0.1 mol/ L氢氧化钠溶液为溶剂，姚曦等[4]用1 mol/L氢氧化钠溶液为溶剂。本文测定的残留溶剂中有乙酸乙酯，因在顶空加热条件下乙酸乙酯可被碱水解生成乙醇，故不宜选择氢氧化钠溶液溶解样品。2 mL 50%吡啶溶液对0.2 g唑来膦酸具有较好的溶解性，其弱碱性对乙酸乙酯的水解作用可忽略不计。

以50%吡啶溶液为溶剂溶解唑来膦酸样品，采用外标法测定5种残留溶剂时，由于存在基质效应，丙酮和乙酸乙酯的回收率接近120%。以正丙醇为内标，采用内标法测定，甲醇、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯和氯苯的回收率在90.0%～110.0%之间，RSD（n=9）小于5.0%，满足了顶空气相色谱法测定残留溶剂的方法学要求。

4结论

本文建立了顶空气相色谱法测定唑来膦酸中甲醇、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯和氯苯等5种残留溶剂的方法，方法学验证试验结果表明该方法灵敏、准确、可靠。

【参考文献】

[1]刘瑶，刘治军，傅得兴.新一代二膦酸盐类药物唑来膦酸的药理与临床[J].中国新药杂质，2004，13（11）：1058-1060.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）[M].北京：中国医药科技出版社，2020.

[3]林生文.頂空气相色谱法测定唑来膦酸氯苯的残留量[J].西北药学杂质，2013，28（4）：369-432.

[4]姚曦，李伟玲.顶空气相色谱法测定唑来膦酸的7种残留溶剂[J].广东药科大学学报，2018，34（4）：430-432.

【作者简介】

陈默，男，1984年出生，主管药师，学士，主要研究方向为化学药品质量分析。

于明，女，1970年出生，主任药师，博士，主要研究方向为化学药品质量分析。

通讯作者：徐万魁，男，1975年出生，主任药师，硕士，主要研究方向为药品质量控制技术研究。联系电话：024-31266300，邮箱地址：xuwank@163.com。

（本稿审读：庞燕军）