液相色谱-质谱联用法快速测定人血浆中他达拉非浓度

徐凤华 黄 明

1.苏州科技城医院药学部，江苏苏州 215153；2.苏州大学附属第二医院药学部，江苏苏州 215004

勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）又称阳痿，具体指阴茎勃起障碍或硬度不够，难以性交或难以维持至射精。循证医学显示ED 是心血管疾病等慢性疾病的早期症状和危险信号[1]。他达拉非（tadalafil）是磷酸二酯酶抑制剂（phosphodiesterase 5，PDE），通过增加平滑肌细胞合成环磷鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）水平，导致动脉血流量增加、静脉充血，能增强勃起功能。临床主要用于治疗男性勃起功能障碍[2-9]。

他达拉非生物样品的内源性物质较多，基质干扰多，浓度低。本研究拟建立简便、快捷的液相色谱- 质谱联用法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法测定人血浆中他达拉非的浓度。他达拉非半衰期较长，平均值为18 h，给药后不同时间点采集受试者血液拟合药时曲线，通常需要采集至96 h，此时血药浓度较低，分析方法的灵敏度显得尤为重要。

1 材料与方法

1.1 实验材料

液相色谱质谱联用仪：Agilent1200 液相色谱仪，AB Sciex API4000 三重串联四极杆质谱仪，数据采集软件Analyst 1.6。XS 105DU 型天平： METTLER TOLEDO。他达拉非（SMS Pharmaceuticals.Ltd，批号为TDF-0415002，含量为98.97%）。地西泮（中国食品药品检定研究院提供，批号为171225-201805，含量为99.8%）。甲醇和甲酸：色谱纯，TEDIA COMPANY 提供。水：超纯水。

1.2 方法

1.2.1 液相和质谱条件 液相条条件：使用C8色谱柱（Agilent，ZORBAX Eclipse plus®C8，规格4.6 mm×100 mm，粒径3.5 μm）；流动相为甲醇：0.2%甲酸水溶液=33 ∶67（v/v），流动相流速700 μl/min；每针7.0 min；进样体积10 μl；柱温30 ℃。质谱条件：电喷雾电离源（ESI），正离子监测；他达拉非母离子和子离子分别为390.2 和268.2，内标地西泮母离子m/z 为285.5，子离子m/z 为154.0，DP 参数分别为40 V 和58 V，CE 参数分别为18 V 和52 V 。离子源温度为700 ℃。

1.2.2 工作液配制 他达拉储备液和工作液：称量10.00 mg 他达拉非、甲醇溶解、容量瓶定容，储备液浓度为1.00 mg/ml。用甲醇稀释，配制工作液，标准曲线工作液浓度为0.01、0.02、0.06、0.20、0.60、2.00、6.00 和18.00 μg/ml，质控工作液浓度为0.03、1.20、12.00 μg/ml，定量下限工作液浓度为0.01 μg/ml。内标地西泮储备液和工作液：称取10.00 mg 地西泮，甲醇溶解、定容。用甲醇稀释，配制2.00 μg/ml的内标工作液。

1.2.3 标准曲线和质控血浆样品配制和处理 吸取200 μl 空白血浆，加入标准曲线10 μl（或质控工作液10 μl），涡旋混匀后，加入50 μl 内标工作液，再加入600 μl 甲醇，振荡混匀约1 min，4℃条件下离心10 min（23 755×g）。吸取100 μl 超纯水，加入100 μl 离心后上清液，混匀后测定。

1.2.4 待测血浆样品处理和测定 吸取200 μl 待测血浆样品，加入补偿体积10 μl 甲醇，涡旋混匀，加入50 μl 内标地西泮工作液，再加入600 μl甲醇，振荡混匀约1 min，4℃条件下离心10 min（23 755×g）。吸取100 μl 超纯水，加入100 μl离心后上清液，混匀后测定。

2 结果

2.1 特异性实验

分别取他达拉非对照溶液（图1 A）、内标对照溶液（图1 B）、空白血浆（图1 C）、他达拉非血浆样品（图1 D），血浆定量下限样品（图1 E），以上样品处理后测定。结果如下：他达拉非和地西泮的保留时间为3.06 min 和4.68 min 左右，血浆中无内源性物质干扰他达拉非和内标地西泮定量分析。

图1 LC-MS/MS 图

2.2 残留

标准曲线最高浓度样品后连续测定3 个空白样品，他达拉非峰面积均为0，内标地西泮峰面积亦为0，残留效应低，不影响他达拉非定量分析。

2.3 标准曲线与最低定量限

吸取200 μl 空白血浆，加入标准曲线工作液10 μl，他达拉非浓度分别为0.50、1.00、3.00、10.00、30.00、100.0、300.0、900.0 ng/ml，按“1.2.3” 项 方法处理测定。结果显示：他达拉非的线性范围为0.50 ～900.0 ng/ml。

2.4 精密度与准确度

吸取200 μl 空白血浆，加入10 μl 最低定量限工作液或3 种不同浓度的质控工作液，他达拉非浓度分别为0.50、1.50、60.00、600.0 ng/ml。结果显示：批内、批间精准度（RSD）均在4.5%～11.1%以内，相对偏差（RE）在±15%范围内，均符合接受标准。

2.5 提取回收率

经提取血浆样品：6 份质控浓度样品，按“1.2.3”项方法处理测定。

未经提取血浆样品：空白血浆甲醇沉淀蛋白，取尽上清液，加入10 μl 质控工作液，再加入50 μl内标地西泮工作液，混匀，吸取100 μl 与超纯水100 μl，混匀后测定。计算经提取和未经提取样品峰面积比值，结果显示：他达拉非低、中、高3 个不同浓度的血浆样品提取回收率为（103.5±9.3）%（n=6）、（96.9±4.5）%（n=6）和（98.8±2.4）%（n=6）；内标提取回收率为（101.3±4.1）%（n=18）。

2.6 基质效应

血浆基质样品：吸取空白血浆200 μl，平行制备6 份，空白血浆来源不同个体，加入甲醇600 μl，涡旋混匀1 min，2 ～8 ℃离心（23 755×g）10 min，取出上层液体700 μl，作为血浆空白基质。

纯溶液非基质样品：吸取超纯水200 μl，参照血浆基质样品处理，得到纯溶液非基质样品。

取血浆基质或非基质样品700 μl，加10 μl入质控工作液和50 μl 内标地西泮工作液，涡旋混匀。吸取100 μl 与100 μl 超纯水，混匀后测定。他达拉非低、中、高三个浓度的基质效应为（100.1±7.2）%、（96.4±6.1）% 和（101.4±7.8）%；内标基质效应为（100.3±3.8）%。低、中、高三个浓度平均内标归一化基质效应分别为99.3%、96.0%、101.6%。

2.7 稳定性实验

本研究考察了他达拉非血浆和储备液样品不同保存条件下他达拉非的稳定性，结果如下：他达拉非血浆样品在室温白光保存24 h、-20℃条件下储存90 d 和-20℃反复冻融循环3 次后，检测结果的平均值相对于理论值的RE 均在±15.0%以内，即血浆样品中他达拉非稳定；待进样样品于液相自动进样器放置48 h（8℃），血浆样品经蛋白沉淀离心后，上清液置于室温白光条放置24 h，他达拉非仍稳定。他达拉非和内标储备液和工作液室温白光放置24 h 和冷藏（2 ～8℃）保存90 d 情况下，他达拉非和内标储备液均稳定。

3 讨论

药物药代动力学研究通常通过测定血液中药物浓度来评价，人血浆他达拉非浓度通常很低，建立一种高选择性、高灵敏度的他达拉非血浆浓度生物分析方法尤为重要。有文献报道，测定血浆样品中他达拉非浓度，血浆样品预处理方法有：①固相萃取法[10-11]：固相萃取色谱柱耗材成本较高。②液液萃取法[12-13]：操作步骤多。③沉淀蛋白法[14-19]：沉淀试剂为乙腈。测定用仪器主要有高效液相色谱-紫外光谱（HPLC-UV）法[12]和HPLC-MS/MS 法[10-11，13-14]。小分子药物生物分析的首选方法为液质联用法，主要优势在于特异性好和灵敏度高。

本研究对液相条件进行了优化考察，水相中加入甲酸，可改善他达拉非和内标地西泮峰形，同时提高他达拉非的响应值，最终选择水相中加入0.2%甲酸时，他达拉非的灵敏度高且出峰时间适中。血浆样品预处理方法中，吸取100 μl 超纯水与100 μl 上清液混匀，有两个目的：其一，防止二次化学平衡，减少他达拉非色谱峰形拖尾；其二，液相色谱进样样品中含有的血浆内源性基质减少，可以减少色谱柱、液质联用仪被污染的可能。

本研究建立简便、快捷的LC-MS/MS 法测定人血浆中他达拉非的浓度，每个样品运行时间短，特异性高，发挥了LC-MS/MS 法的快速定量优势。血浆前处理为甲醇沉淀血浆蛋白，操作快捷，优于固相萃取法[10-11]和液液萃取法[12-13]。他达拉非在人体代谢半衰期比较长，平均值为18 h，临床研究采集给药后受试者的血液，通常需要采集至96 h，此时血药浓度较低，分析方法的灵敏度显得尤为重要。目前，在我国市售他达拉非片在主要有5 mg 和20 mg 两种规格。国内外文献[10-11，13，15-17]报道了10 mg 和20 mg 规格他达拉非片药动学参数。5 mg规格他达拉非片药动学参数文献报道较少，临床研究5 mg 规格他达拉非片药动学参数时，高灵敏度检测方法显得尤为重要，本研究定量下限为0.50 ng/ml，低于文献报道[12-19]，为人血浆中他达拉非浓度检测提供手段。