超量表达OsPTR9基因对低氮胁迫时杨树耐受性的影响1)

赵会敏 姚新转 张传明 吕立堂

(贵州大学,贵阳,550025)

城乡绿化土壤中的氮元素分布并不均匀[1],过量的补充氮素也会对土壤环境造成影响[2],这为人工补充氮元素带来了极大的困难。同时,氮素作为植物生长和生产中的限制性养分之一,缺少或过量都会对其生长和发育产生严重影响[3-4]。因此,培育可以耐受低氮环境的林木品种,对于城乡绿化具有重要意义。杨树是林业研究领域的模式植物,其基因组相对较小,易于进行遗传研究;同时其适应性强,生长速度快,具有优良的实验特性,已利用基因工程技术对其进行了抗病虫、抗寒冻、抗旱、抗盐碱等机制研究[5-6]。由于具有树干通直挺拔、根系发达、枝叶长势繁茂、抗寒抗旱能力强、生长速度快、寿命长等优点,被广泛用于速生用材林和防护林[7]。有研究发现,毛杨树具有较强的抗空气中粉尘及有毒气体的效果[8],是一种比较理想的城乡绿化树种。

由于植物吸收、同化和利用土壤中的氮是通过多种途径进行的[9],而高亲和、低亲和的硝酸盐转运系统同化和吸收硝态氮是其主要途径[10-11]。通常情况下,植物通过低亲和转运系统调控高氮环境中氮的吸收同化,通过高亲和转运系统调控低氮环境中氮的吸收同化[12]。因此,利用植物这种调节自身相关基因表达量以适应外界低氮胁迫环境的作用机制[13],通过转入外源基因诱导植物氮代谢相关基因表达量发生变化[14],是一种切实有效的提高植物氮素利用率的途径[15]。Fang et al.[16]在对低亲和力硝酸根转运家族PTR/NRT1(NPF)中的小肽转运蛋白OsPTR9进行研究时发现,OsPTR9在水稻各个组织均有表达,其表达量与外源氮素含量具有明显的相关性;同时,在同样条件下培养的OsPTR9基因的超表达、RNA干涉和敲除植株,其氮素吸收利用和相关表型与野生型植株出现了明显差异,并且其表达量与水稻吸收铵密切相关。

小肽转运蛋白OsPTR9可以促进水稻中铵的吸收并提高其氮代谢效率,但关于其在木本植物中的功能的研究较少。为此,本研究以三倍体毛白杨(PopulusL.)为试验研究对象,采用农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的遗传转化方法将OsPTR9基因转入杨树中,经聚合酶链式反应(PCR)鉴定获得15株转基因植株;以野生型杨树无菌苗叶片为材料进行遗传转化继代培养的野生型杨树无菌组培苗为对照;参考霍格兰营养液配方配置低氮营养液,选取长势基本一致的4个杨树株系进行低氮胁迫处理,观测其低氮胁迫表型、测定其氮磷钾质量分数和氮代谢相关基因表达量,分析转基因杨树植株对低氮环境的耐受性。旨在为探索杨树应对低氮胁迫的调控机制、后续开展植物的氮调控相关研究提供参考。

1 材料与方法

试验所用毛白杨品种为三倍体毛白杨(PopulusL.),来源于金华职业技术学院师范学院,培养条件:光周期为16 h光照(28 ℃)、8 h黑暗(25 ℃),光合有效辐射为90 μmol·m-2·s-1。

OsPTR9超表达载体委托武汉伯远生物有限公司构建,农杆菌菌株LB4404由本实验室保存,相关引物由北京攀科新业生物技术有限公司合成。

杨树遗传转化及分子鉴定方法:采用农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的遗传转化方法转化杨树[17]。以野生型杨树无菌苗叶片为材料进行遗传转化,4周后愈伤组织长出,进行继代培养获得抗性芽,抗性芽长至2～3 cm,然后将抗性芽切下,置于生根培养基上生根培养。4周后待无菌苗长至7～10 cm炼苗2 d后移栽到砾土盆中。从杨树叶片中提取DNA,利用OsPTR9基因序列设计检测引物。

低氮胁迫杨树幼苗的试验设计:参考霍格兰营养液配方[18],配置低氮营养液(见表1)。杨树转基因幼苗和野生型幼苗移栽培养初期,施加低氮营养液100 mL/盆,同时补充适量的硝酸铵,待其生长稳定后,逐步削减硝酸铵补加量,直至降为0.01 mg/L后,开始进行低氮胁迫处理。植株低氮处理期间,低氮营养液3 d添加1次,同时补充足量水分;处理60 d后,观察超量表达OsPTR9基因的杨树与野生型杨树的表型差异;采取杨树顶端往下的第四片叶片,液氮速冻后,-80 ℃保存用于后续试验。

表1 借鉴霍格兰营养液配方配置的低氮营养液配方的各种化合物溶液的母液添加量

低氮胁迫处理后杨树氮、磷、钾质量分数测定方法:将保存在-80 ℃的杨树叶片样本烘干研磨粉碎后,采用消煮法检测其氮、磷、钾质量分数。用H2SO4-H2O2消解样品后,应用凯氏定氮仪在碱性条件下(NaOH)测定N元素质量分数,应用NaHCO3浸提-钼锑抗比色法定量测定P元素质量分数,应用NH4OAc浸提-火焰光度计法定量测定K元素质量分数[19-20]。

氮代谢途径相关基因表达量检测方法:提取保存在-80 ℃的杨树叶片总RNA,反转录得到cDNA。以Actin为内参基因,利用荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测氮代谢相关基因的相对表达量[17],引物见表2。

表2 相关基因反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)引物序列

数据处理:采用EXCEL软件、GraphPad Prism 8对试验数据进行处理,试验经3次生物学重复。

2 结果与分析

2.1 转基因杨树植株的获得

长势基本一致的8株超量表达OsPTR9基因的杨树,聚合酶链式反应鉴定结果均为阳性(见图1),表明OsPTR9基因成功导入杨树中;对进行低氮胁迫处理的4个转基因株系中OsPTR9基因的定量结果(见表3),表明OsPTR9基因在杨树中超量表达。

WT为野生型杨树植株;LN1～LN8为8株超量表达OsPTR9基因的杨树植株。

表3 OsPTR9基因在杨树不同株系中的表达量

2.2 超量表达OsPTR9基因对低氮胁迫时杨树生长发育的影响

选取3个超量表达OsPTR9基因的杨树株系(LN1、LN2、LN3)进行低氮耐受型试验,发现低氮胁迫处理28 d后,野生型杨树幼苗出现了明显的低氮症状,叶片泛黄、枯萎、直至脱落;超量表达OsPTR9基因的杨树幼苗无明显低氮症状(见图2)。此外,选取低氮胁迫60 d后的1个株系(LN4)和野生型杨树,观察表型发现,野生型杨树叶片偏小(见图3a)、植株矮小(见图3b),发育迟缓;而转OsPTR9基因杨树叶片偏大(见图3a)、植株健壮(见图3b)。其中,LN4株系最大叶片长度为野生型最大叶片长度的1.8倍、最大叶片宽度为野生型最大叶片宽度的2.4倍、株高为野生型株高的2.1倍(见表4)。表明超量表达OsPTR9基因提高了杨树对低氮胁迫的耐受性,可以有效促进低氮胁迫时杨树的生长发育。

WT为野生型杨树植株;LN1、LN2、LN3为3株超量表达OsPTR9基因的杨树植株。

WT为野生型杨树植株;LN4为超量表达OsPTR9基因的杨树植株。

表4 低氮胁迫处理60 d后野生型、转基因型杨树的叶片尺寸和植株高度

2.3 转基因型杨树与野生型杨树叶片的氮、磷、钾质量分数差异

超量表达OsPTR9基因的杨树叶片氮、磷、钾质量分数,均高于野生型杨树(见表5),其中氮质量分数增加了15%、磷质量分数增加了19%、钾质量分数增加了21%;说明超量表达OsPTR9基因,可以促进植物在叶片储存更多的N、P、K,缓解低氮胁迫时的生存压力。

表5 低氮胁迫处理60 d后野生型杨树和转基因型杨树叶片的氮、磷、钾质量分数

2.4 超量表达OsPTR9基因对杨树中氮代谢相关基因表达的影响

为进一步分析超量表达OsPTR9基因在杨树低氮胁迫时的作用机制,对转基因和野生型杨树中一些氮代谢相关基因的相对表达量进行了检测。结果表明,杨树中氮代谢相关基因在转基因株系和野生型中的表达量出现了明显差异(见表6)。其中,转基因株系中,高亲和力硝酸盐转运蛋白(NRT2.5)基因表达量,为野生型的10.6倍;高亲和力钾转运蛋白(HAK5)基因的表达量,为野生型的1.9倍;谷氨酸合成酶(GOGAT1、GOGAT2)基因表达量,是野生型的1.5倍、2.7倍;谷氨酰胺合成酶(GS1.1、GS1.2、GS1.3、GS2)基因表达量,是野生型的79.7倍、10.9倍、27.2倍、5.3倍;PTR1.2、PTR2.11、PTR3.1、PTR6.3基因表达量,分别为野生型的3.6倍、2.2倍、2.1倍和2.5倍。综合以上结果,说明超量表达OsPTR9基因促进了杨树中氮代谢相关基因的表达;促进高亲和力硝酸盐转运蛋白、谷氨酰胺合成酶基因的高表达,是OsPTR9基因调控杨树在低氮胁迫时生长发育的主要途径。

表6 氮代谢相关基因在转基因型株系和野生型杨树中的表达量

3 讨论与结论

超量表达氮代谢相关的基因,是一种非常有效的可以改变植物低氮耐受性的方法。在烟草[21]、拟南芥[14]等模式植物中得到了验证。本研究将水稻中发现的与氮吸收和氮代谢相关的OsPTR9基因[16],通过农杆菌介导的叶盘转化法导入杨树中,随后对获得的转基因杨树进行低氮胁迫处理。结果表明,转OsPTR9基因杨树表现出了明显的低氮耐受性,缺氮症状出现时间比野生型明显延后,低氮处理时生长状况明显优于野生型,说明OsPTR9基因可以提高植物对低氮胁迫的耐受性;但其相应的作用机制尚待进一步的研究。

氮、磷、钾对植物的生长发育和抗逆性有着重要的影响。通常情况下,植物在低氮胁迫时,会通过减少磷的摄入降低代谢水平,以维持其基本的生存[22],促进钾的吸收以提高氮利用率[23-24]。而叶片作为植物储存和同化氮磷钾的重要器官,叶片氮磷钾质量分数可以在一定程度上反映出植物整体的氮磷钾质量分数[25]。已有研究表明,OsPTR9的表达受铵态盐的调控,并且OsPTR9基因表达量降低对植株冠根、株高、生长量有负面影响[16]。本研究结果表明,低氮处理后转基因杨树植株高度和叶片大小,显著高于野生型;转基因叶片中的氮磷钾质量分数,显著高于野生型。在低氮环境下超量表达OsPTR9基因促进了铵的摄取,增加了根中和叶片中的氨基酸质量分数,保证了杨树植株正常的生长发育,并使其生物量增加,从而提高杨树的耐受性。但目前对于氮、磷、钾在叶片存储量的增加,是通过从外界环境中吸收氮、磷、钾这一途径,还是通过提高杨树中氮、磷、钾的代谢效率从而降低氮、磷、钾的损耗的方式,还有待探究。