7种典型旱生藓类的组织培养1)

张霄 于雯馨 薛宇博 胡丁丁 冯超

(内蒙古农业大学,呼和浩特,010011)

内蒙古地处干旱、半干旱气候带,具有气候酷寒、干旱缺水、沙化严重等特点,导致植被生长困难,生态环境十分脆弱[1]。当前的植被恢复困难,适宜北方草原退化生境予以修复的乡土物种稀缺,现有措施效果局限,需要寻找适宜的物种及其他植被恢复方法。

苔藓植物作为先锋物种,在环境污染监测方面存在巨大的价值与潜力[2-4],在防止雨滴对土壤的影响、保护表土、延缓地表径流侵蚀、构建抗侵蚀土壤结构等方面具有重要作用[5-10]。但是,旱生苔藓自然分布较少,非常容易受到地面表面的干扰,而且其结皮层从干扰中自然恢复需要的时间较长[11],严重限制了其在水土保持等领域的应用。魏志颖等[12]研究表明,蔗糖对于山墙藓原丝体的形成和扩展生长均具促进作用,质量浓度为30 g/L时原丝体形成时间最早、扩展直径最大,但抑制了芽体的分化,质量浓度为15 g/L时对芽体分化具明显促进作用。李育中等[13]使用液体培养基对双色真藓进行悬浮培养,并进行了孢子培养与愈伤组织的诱导。Zhao et al.[14]使用液体培养基建立泥碳藓培养体系,并发现线状原丝会随着片状原丝体增加而减少。因此,快速人工栽培对于加速在恶劣环境下苔藓结皮层的恢复具有重要的现实意义。

Tao et al.[15]研究表明,霍格兰(Hogland)培养基对沙漠苔藓地壳的生长有促进作用。关于苔藓组织培养,已经探索出影响苔藓繁殖的多个因素,如水分、光照、pH、培养基种类及激素使用等因素,都与苔藓的繁殖方式与速度存在关联,但其在不同破碎程度时苔藓的生长周期及其对培养基中元素的吸收程度,研究的较少。为此,本研究在对内蒙古草原分布调查的基础上,选定角齿藓(Ceratodonpurpureus(Hedw.)Brid.)、丛生真藓(BryumcaespiticiumHedw.)、葫芦藓(FunariahygrometricaHedw.)、赤藓(Syntrichiasinensis(Müll.Hal.)Ochyra)、绢藓(Entodoncladorrhizans(Hedw.)Müll.Hal.)、紫萼藓(GrimmiaplagiopodiaHedw.)、垂枝藓(Rhytidiumrugosum(Hedw.)Kindb)这些类群作为培养对象,通过整株、高打碎、低打碎3种不同接种方式以及3种不同pH梯度(6、7、8)的诺普(Knop)培养基进行组织培养;观察苔藓样品生长周期、破碎程度的生长方式及3种pH梯度对苔藓样品生长的影响,分析苔藓对金属元素(Zn、Ca、Mg、K)和非金属(N、S、P)吸收程度及苔藓样品生长所需营养成分,探索苔藓物种的快速繁殖方法;旨在为内蒙古草原旱生藓类的大规模繁殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验用苔藓类群遴选及来源

在自然环境中,旱生藓类由于其生长缓慢,严重制约其生态功能的应用,而旱生藓类大面积繁殖还处于空白,特别是培养中最关键的繁殖方式和元素吸收的研究较少。本研究在前期对内蒙古草原分布调查的基础上,最终选定角齿藓、丛生真藓、葫芦藓、赤藓、绢藓、紫萼藓、垂枝藓这些类群作为培养对象。

角齿藓、丛生真藓、葫芦藓——收集于中国内蒙古自治区锡林郭勒盟胜利矿区(地理坐标:北纬43°2′～44°52′、东经115°13′～117°6′);该地年平均气温3.6 ℃,年平均降水量289 mm,年平均风速4.5 m/s,土壤类型为风沙土质。

赤藓——收集于中国内蒙古自治区锡林郭勒浑善达克沙地(地理坐标:北纬41°56′～44°26′、东经112°22′～117°57′);该地年平均气温1.5 ℃,年平均降水量东部为365.1 mm、西部为156.5 mm,年平均风速4.5 m/s,土壤类型为风沙土和栗钙土。

绢藓、紫萼藓——收集于中国内蒙古自治区呼和浩特市大青山环境保护区(地理坐标:北纬40°34′～41°14′、东经109°47′～112°17′);该地年平均气温14.1 ℃,年平均降水量849 mm,年平均风速2.72 m/s,土壤类型为栗钙土质。

垂枝藓——收集于中国内蒙古自治区呼伦贝尔市(地理坐标:北纬47°5′～53°20′、东经115°31′～126°4′);该地年平均气温0 ℃,年平均降水量350.5 mm,年平均风速3.2 m/s,土壤类型为黑土、暗棕壤、黑钙土、草甸土质。

在其相应生境内,选取生长良好且发育一致的苔藓群落,随机选取3个样点,使用铲子分别采取赤藓、角齿藓、丛生真藓、葫芦藓、绢藓、垂枝藓、紫萼藓,取得样品21份,封存后运回实验室备用。

1.2 组织培养苔藓的培养基的配制

本研究试验选取诺普(Knop)液体培养基进行组织培养试验。培养基成分:硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)为1 000 mg、硝酸钾(KNO3)为250 mg、磷酸二氢钾(KH2PO4)为250 mg、硫酸镁(MgSO4·7H2O)为250 mg、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)为3 mg、蒸馏水为1 000 mL。

1.3 苔藓植株的破碎处理及组织培养苔藓的接种与培养

将诺普培养基倒入3个1 L锥形瓶中,使用盐酸和氢氧化钠溶液调节pH为6、7、8。将其均分于63个100 mL的三角瓶中并用封口膜包裹;使用高压蒸汽灭菌锅将实验工具进行灭菌。2 h后,取出工具置于超净台内,同时打开超净工作台的紫外射线灯与通风装置,对培养工具及超净工作台进行35 min的消毒工作。

将植株放入蒸馏水中浸泡至植物体完全舒展,将其依次放置在解剖镜下观察,并使用蒸馏水冲洗苔藓表面的泥土、沙粒等杂质。重复以上步骤,直至无明显杂质且保留其完整假根。

本试验采取3种植株处理方式,即高破碎处理、低破碎处理、整株。高打碎处理,即使用美国Next Advance快速组织细胞破碎仪8档,运行1 min,将苔藓植株进行破碎处理为平均长度1 mm的小段;低打碎处理,即使用刀片,将苔藓植物切为其长度1/3的小段。在超净工作台内使用体积分数为70%的酒精浸泡30 s,然后放入无菌水漂洗并用滤纸吸干;重复以上步骤3次。将各处理以此接种到诺普培养基上,每个培养基接种3株苔藓,并设置3个重复。接种完毕,将苔藓放置于布鲁帕德(Blue Pard)培养箱中(培养温度25 ℃,光照强度2 500～3 500 lx,光照光照12 h、黑暗12 h),培养30 d。诺普培养基包括4种金属元素(Zn、Ca、Mg、K)、3种非金属元素(N、S、P)。

1.4 组织培养苔藓培养基消毒时间及消毒剂的筛选

苔藓组织培养的相关研究,主要集中在培养基成分选择、消毒方式、组培条件筛选等方面。选择体积分数为70%的无水乙醇、质量分数为5%的次氯酸钠溶液作为消毒试剂,设计8个消毒方案(30 s乙醇+10 s次氯酸钠、30 s乙醇+5 s次氯酸钠、30 s乙醇+0 s次氯酸钠、20 s乙醇+10 s次氯酸钠、20 s乙醇+5 s次氯酸钠、20 s乙醇+0 s次氯酸钠、10 s乙醇+10 s次氯酸钠、10 s乙醇+0 s次氯酸钠),将苔藓外植体做以上梯度处理后接种到诺普培养基上。20 d后,通过观察其外植体的状态、成活率以及染菌情况,不同苔藓植物适应的消毒时间与消毒液种类存在差异,通过梯度试验最终确定“30 s乙醇+0 s次氯酸钠”为多数外植体消毒的最佳方案。

1.5 苔藓培养基剩余元素的测定

培养30 d后,选择pH为6的培养基,取出外植体、原丝体后,将剩余培养液使用无磷滤纸过滤3次,直至无明显杂质;使用原子吸收光度计-火焰法测定Zn、Ca、Mg、K元素,使用流动分析仪测量N元素;使用硫酸钡比浊法测定S元素,使用钼锶胺比色法测定P元素。

标准曲线的制定:采取原子吸收光度计-火焰法对其进行检测,取5.0 mL钙元素标准溶液(1 000 mg/L)置于50.0 mL容量瓶中,得到质量浓度为100 mg/L的钙使用液;再分别吸取0、0.5、2.5、5.0、7.5 mL钙标准液加入50.0 mL的容量瓶,并定容至刻度线,最终得到质量浓度为0、1.0、5.0、10.0、15.0 mg/L的标准液。用同样方法绘制钾、镁、锌元素标准曲线。

样品处理:标准溶液配制完毕后,将仪器置于工作状态,开始空烧;待仪器基线稳定后,调节基线和增益;待基线稳定后,进行标准曲线各质量浓度点的测定;标准曲线测定完毕后,开始测量待测样品。设置空白对照组3个重复,将配好的空白诺普培养基与其它样本在相同条件环境放置35 d。35 d后,取出培养的pH为7的苔藓样本及其原丝体,使用9 mm无磷滤纸将液体培养基过滤2次,直至无杂质,使用原子吸收光度计-火焰法进行测定。依据测定结果,分析不同苔藓对于元素的吸收程度;测定剩余元素越多,说明此种苔藓样本对于该元素的吸收量相对越少。

1.6 数据处理

试验设置3次重复,数据均采用SPSS26.0统计软件中的单因素方差分析、多因素方差分析方法,比较其差异性。

2 结果与分析

2.1 不同破碎处理对苔藓植物生长的影响

不同植株的破碎处理,对苔藓植物的生长产生影响。根据观测统计(见表1),整株与低打碎处理样本的生长率,高于高打碎处理的苔藓样本。不同的pH环境影响其破碎程度的生长率,在pH为8的培养环境时,高破碎程度的苔藓整体生长率,显著高于整株、低破碎程度苔藓生长率;在pH为7的培养环境时,整株程度的苔藓整体生长率,显著低于高破碎程度苔藓生长率。赤藓、丛生真藓、紫萼藓、垂枝藓高破碎处理成功生长的株数,分别占其破碎程度株数的55.56%、88.89%、88.89%、100%,高于整株、低打碎处理,表明其适用于高破碎方式繁殖。葫芦藓,绢藓的低破碎处理成功生长的株数,分别占其破碎程度株数的66.67%、88.89%,高于整株、高打碎处理,表明其适用于低破碎的繁殖方式。部分苔藓植物,高破碎后更倾向于产生大量的原丝体,而低打碎植株更倾向于产生大量的茎叶体,最终发展成完整的植株。

表1 不同破碎处理的苔藓植物在不同pH培养环境时的总体生长率

2.2 培养基pH对苔藓植物生长的影响

采取梯度试验,配剂pH为6、7、8的诺普培养基,将苔藓外植体接种于培养基中培养35d期间观察记录其生长状况。由图1可见:在诺普培养基中,不同pH对苔藓植物原丝体及茎叶体的生长量和发育时间产生显著的影响。高pH对于紫萼藓的生长有明显的促进作用,而对丛生真藓、赤藓具有明显抑制作用。与pH为6、pH为8相比,pH为7时的培养基能够使角齿藓、赤藓、葫芦藓、绢藓、垂枝藓的增长速度较为稳定。在培养32 d时,各个pH培养环境的苔藓生长趋于平稳,达到最高峰值。经过35 d的观察记录发现,原丝体量随着茎叶体量升高而下降,推测减少的部分原丝体转化为茎叶体,从而继续生长。

—■—pH=6;—●—pH=7;—▲—pH=8。

2.3 金属元素对苔藓植物生长的影响

随着培养试验的持续,苔藓培养基内钾离子质量浓度呈现下降的变化趋势。经过测量,空白对照组钾离子的平均剩余量为39.17 mg/L。由表2可见:角齿藓对钾离子的吸收量最高,其培养基中剩余钾离子质量浓度平均为4.63 mg/L,吸收了对照组平均值的88.20%;绢藓培养基中剩余钾离子质量浓度平均为4.63 mg/L,吸收了对照组平均值的88.17%;垂枝藓培养基中剩余钾离子质量浓度平均为4.83 mg/L,吸收了对照组的87.66%;角齿藓为小型苔藓,绢藓与垂枝藓为大型藓种,说明苔藓的形态大小与其吸收钾元素的量不成正比。而葫芦藓对钾离子的吸收量较小,仅仅吸收了对照组的61.68%;赤藓、紫萼藓、丛生真藓培养基中剩余钾离子质量浓度平均分别为6.45、6.18、9.40 mg/L。苔藓对元素吸收量的差表明,在培养苔藓过程中,不同苔藓所需要添加的元素质量浓度有所差异,适当增加培养基中钾元素的质量浓度对其有促进作用。

表2 苔藓培养基中4种金属离子的剩余量

随着培养试验的持续,苔藓培养基内钙元素质量浓度呈现下降的变化趋势。经过测量,空白对照组钙离子的平均剩余量为81.98 mg/L。由表2可见:与其它藓种相比,绢藓对钙离子吸收量较大,平均吸收了空白对照的23.46%;其余藓种对钙离子吸收量差异不大,角齿藓培养基中剩余钙离子质量浓度为65.97 mg/L,吸收了空白对照的19.52%;丛生真藓培养基中剩余钙离子质量浓度为66.27 mg/L,吸收了空白对照的20.10%;葫芦藓培养基中剩余钙离子质量浓度为65.91 mg/L,吸收了空白对照的19.60%;赤藓培养基中剩余钙离子质量浓度为65.50 mg/L,吸收了空白对照的19.16%;紫萼藓培养基中剩余钙离子质量浓度为65.84 mg/L,吸收了空白对照的19.69%;垂枝藓培养基中剩余钙离子质量浓度为65.68 mg/L,吸收了空白对照的19.87%。7种苔藓对钙离子吸收量的差异不显著。从试验数据看,在绢藓的培养过程中,适当增加钙离子质量浓度是必要的。

由表2可见:在诺普培养基的离子质量浓度范围内,7种苔藓吸收了空白对照的100%,说明镁离子、锌离子是苔藓发育过程中至关重要的元素。在今后的试验中,可以适当提高镁离子、锌离子的质量浓度,观察其吸收程度。

2.4 非金属元素对苔藓植物生长的影响

采取钼酸胺-抗坏血酸比色法测定磷离子质量浓度。由表3可见:绢藓对磷的吸收量最大(平均仅剩余0.64 mg/L),而与其它苔藓相比,角齿藓对磷的平均吸收量最小(剩余2.21 mg/L)。不同种类苔藓对磷的吸收量不同;整体看,除紫萼藓、角齿藓、绢藓以外,每个苔藓对磷的吸收量差异不显著。使用流动分析仪测定硝态氮质量浓度。由表3可见:绢藓对硝态氮的吸收量最大;与其它苔藓相比,角齿藓对硝态氮的平均吸收量最小,平均剩余0.43 mg/L;说明不同种类苔藓对于硝态氮的吸收量不同。整体看,大型、中型藓种(如垂枝藓、绢藓、赤藓)对于硝态氮的吸收量较高,而小型藓种对硝态氮的吸收相对较少。在此后培养方案中,可以根据苔藓配子体的形态大小适当增加氮的质量浓度,以此提高其产量。

表3 苔藓培养基中3种非金属离子的剩余量

使用硫酸钡比浊法测定硫离子质量浓度。取5支50 mL比色管,分别加入0、1、3、5、7 mL硫酸盐标准溶液(0.05 mg/L),用蒸馏水稀释至25 mL,加入8滴HCl、5 mL无水乙醇;摇匀后,加入5 mL氯化钡(BaCl)溶液;以一定的方式振摇60 s,静置5 min后作为标准浊度,在波长420 nm处测量吸光度。以硫酸根浓度为横坐标、吸光度为纵坐标,绘制校准曲线。由表3可见:垂枝藓对硫的吸收量最大,与其它苔藓相比,葫芦藓对硫的平均吸收量最小,不同苔藓对于硫元素的吸收量差异显著(P<0.05)。黄丽雅等[16]研究表明,硫是植物生长发育所必需的营养元素之一。硫不仅参与半胱氨酸和蛋白质等初生代谢产物的合成,还与硫代葡萄糖苷、植保素、植物螯合肽、维生素、辅酶A等次生代谢物质的合成密不可分。因此,适量的硫可以促进植物的生长发育,提高作物产量和质量,提高植物受环境胁迫的能力。

3 讨论与结论

矿区的大量开采,会对周围土壤环境造成重金属污染。王登富等[17]对废弃卡林型金矿区苔藓进行研究表明,硬叶扭口藓(Barbularigidula)对Zn、Cd具有较强的富集能力,可作为Zn、Cd重金属污染监测的指示植物;匡其羽等[18]研究表明,藓类多样性与重金属污染之间的关系,能够成为王家湾金矿区多种金属污染的生态监测指标之一。本研究表明,不同苔藓对不同的金属元素吸收程度不同,对钙离子的吸收,比对钾离子的吸收相对少,但仍然是不可或缺的元素之一。在非金属元素中,不同苔藓对非金属元素吸收程度的差异,比不同苔藓对金属元素吸收程度的差异大,尤其是大型藓种其吸收的P、S、N明显高于其它中小型藓种。通过研究苔藓对于元素吸收的差异性,能够为苔藓作为指示植物富集功能提供新思路。

苔藓配子体的消毒方式,决定着苔藓组织培养试验的成败,不同苔藓对于消毒剂的耐受度不同,需要谨慎选择消毒剂类型,严格把控消毒时间。高叶青[19]使用体积分数为75%酒精浸泡30 s和质量浓度为0.1 g/L氯化汞消毒90～120 s,无菌水漂洗至少3次。但根据本研究试验过程看,体积分数为70%的无水乙醇,比质量浓度为0.1 g/L氯化汞与体积分数为1%次氯酸钠溶液更易提高苔藓样本的成活率,并同时降低苔藓样本的感染率。本研究表明,大型苔藓(如垂植藓、绢藓等苔藓)更易出现叶片发黄等现象,因此要特别注意减少其消毒时长,并使用无菌水漂洗至少3次。

在本次pH梯度试验中发现,pH为6培养基的苔藓原丝体出现的时间较早,且大幅度缩短了其由原丝体发育为茎叶体的时间。在今后大面积培养试验中,可以考虑采用偏酸性的基质,缩短其发育时间,以增加其产量。在今后大面积培养方案中,为某种目标苔藓定制其适应的培养基,能够有效地减少成本、提高产量。