鬼伞属中国新记录种——椰枣色孢鬼伞1)

武艳群 何轶榕 刘淑琴 王腾云 孟俊龙 常明昌 王术荣

(山西农业大学,太谷,030801)

鬼伞属(CoprinusPers.)隶属于伞菌纲(Agaricomycetes),伞菌目(Agaricales),伞菌科(Agaricaceae),是Pers[1]于1979年创立的。鬼伞属的模式种是灰色鬼伞(CoprinuscinereaSchaeff.)。鬼伞属是高等担子菌里研究较为集中的一个属,该属的特点是具有自溶的片层以及深色的孢子[2],经常食用的鸡腿菇就是鬼伞属的一种——毛头鬼伞(C.comatus)。

国外对鬼伞属的研究始于1914年,Levine[3]对晶粒鬼伞(Coprinusmicaceus)进行了详细的观察,未发现菌褶腔;1941年Johnson[4]研究了古巴鬼伞(C.cubensis)的个体发育过程,认为其与绒毛鬼伞(C.tomentosus)亲缘关系相近;1976—1979年,Bogart[5-7]将鬼伞属分成Coprinus、Lanatuli、Atramentarii三个部分,并对部分物种进行了详细的描述;1979年Reijnders[8]研究了鬼伞属27个种的个体发育组织结构的形成,并试图建立这些种的系统发育关系。国内对鬼伞类的研究最早始于周宗璜[9],1931—1934年,他先后发表了关于鬼伞菌子实体的发育、茸毛鬼伞菌的个体发育、鬼伞菌类个体发育的3篇文章,在鬼伞类的个体发育研究中取得了重要进展;1963年邓叔群[10]在《中国的真菌》描述了我国鬼伞属真菌14种,随后1979年戴芳澜[11]在其著作《中国真菌总汇》中记录了该属18种;2000年卯晓岚[12]收录了该属15种,之后臧穆[13]、毕志树[14]、张东柱[15]、张树庭等[16]分别在其论著中对鬼伞属真菌物种进行了补充。

五台山是国家5A级旅游景区,国家地质公园,是国家自然与文化的双重遗产[17],位于山西省忻州市、五台县东北部,地处北纬38°50′～39°5′、东经113°29′～113°44′,属于太行山系的北端,总面积2 837 km2[18]。五台山地层主要是以前寒武系地层为主,植被主要以草地为主,全年平均气温为-4 ℃。五台山完整的地层、多样化的植被类型、适宜的气候,赋予了五台山生物的丰富性,蕴藏着丰厚的菌物资源[19]。2019年,研究者在对山西省五台山自然保护区的野生大型真菌资源进行调查时,发现一种鬼伞属的物种,并对其进行了详细的形态学观察和分子系统发育分析,鉴定结果显示,该物种与Bogart在1976年发表的椰枣色孢鬼伞(Coprinusspadiceisporus)是同一物种,属于中国鬼伞属的一个新记录物种。鉴于此,本研究对其进行了详细的形态描述,并与其近似种进行了比较。

1 材料与方法

供试验的鬼伞属标本(1份)采自于山西省五台山自然保护区,编号G10808(H18),现存放于山西农业大学菌物标本馆(HMSAU)中。

形态学鉴定采用宏观观察和显微观察相结合的方法。宏观特征的观察主要包括子实体颜色、形状、大小等;显微结构观察在光学显微镜(Nikon Eclipse Ni-U)下进行,用质量分数为5%的KOH溶液作为浮载剂,主要观察孢子和担子的颜色、形状以及测量其大小等。在100倍物镜下,随机选择30个成熟孢子、担子进行测量,计算孢子的大小范围、长宽比(Q)[20]。

DNA的提取、扩增和测序:使用E.Z.N.A.®Forensic DNA Kit试剂盒,从干燥的真菌子实体中提取基因组DNA,测定DNA质量摩尔浓度后,将提取的DNA置于-20 ℃条件下保存,备用。

以提取的基因组DNA作为模板,遵循Vilgalys和Hester协议[21],使用引物对ITS8-F/LR3用于内转录间隔区域的聚合酶链式反应(PCR)扩增,反应扩增程序:94 ℃,5 min;35个循环(94 ℃,0.5 min;55 ℃,0.5 min;72 ℃,1 min);72 ℃,5 min[22]。

扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,电泳程序为100 V,45 min,检测合格的产物用E.Z.N.A.®Cycle-Pure Kit试剂盒纯化后,送往生物工程(上海)有限公司进行正反向测序。

内转录间隔区序列处理和系统发育分析:将测序得到的内转录间隔区序列在分子进化遗传学分析软件(MEGA X)[23-24]中进行复检,经过人工校正排除程序误读。然后将序列放入国家生物技术信息中心(NCBI)网站的基于局部比对算法的搜索工具(BLAST)中进行比对,得到序列的相似度信息,确定其所在属和相似种。将测序所得的序列和从NCBI中得到的近似种序列用MEGA X软件中的多序列比对工具(Clustal W)进行比对,进行手工调整对齐。以烟云杯伞(序列号DQ486691)做外类群,用MEGA X软件采用最大似然法(ML),选择GTR+G作为最佳模型,自举值1 000次构建系统发育树。

用简约性系统发育分析软件(PAUP)对序列进行格式转换,用核苷酸替换模型MrModelTest、ModelTest等对片段进行模型选择,基于赤池信息量准则(AIC)选择GTR+I+G为最佳模型,采用贝叶斯分析法[23](BI),使用贝叶斯软件(MrBayes 3.2.6)构建系统发育树,形成的树文件用软件Figtree v1.4查看并编辑,节点支持值由最大似然法支持率或贝叶斯后验概率共同组成。

2 结果与分析

2.1 椰枣色孢鬼伞的形态学分析

子实体(图1)小型。未成熟时菌盖是钟形,中央为黄褐色,边缘颜色逐渐呈白色;成熟后菌盖会慢慢展开,展开后菌盖中央呈现褐色,边缘变为灰色;菌盖直径3.1～4.2 cm;表面附有许多黄褐色鳞片,具条纹,成熟后沿着条纹开裂,逐渐自溶。菌肉较薄,白色至浅灰色。菌褶直生,致密,初期为白色,成熟后颜色渐深,呈灰色至黑色,不等长。菌柄中生,白色,长圆柱形,长1.3～5.5 cm,直径0.3～0.5 cm,中空,具有纵向条纹。

图1 椰枣色孢鬼伞子实体的宏观形态特征

孢子(图2A)深棕色,椰枣色,宽椭圆形至椭圆形,(9.0～11.0)μm×(5.5～6.5)μm,长宽比为1.4～1.6,壁薄光滑,具有明显的芽孔;担子(图2B)长棍棒状或近圆柱形,(28.0～40.0)μm×(10.0～28.0)μm,有4个担子小梗,小梗长约5 μm;缘囊体(图2C)卵球形,不规则椭球形,大多数(25.0～50.0)μm×(10.0～25.0)μm,有个别长达95 μm;无其他囊状体。

A为孢子;B为担子;C为缘囊体。

生境:夏、秋季散生于以杨属和栎属为主的阔叶林中地上。

分布:欧洲、北美洲[25]。

研究标本:中国山西省忻州市繁峙县五台山自然保护区,地理中心坐标为北纬39°42′36″、东经113°19′12″,海拔2 089 m;编号G10808(H18);采集人为原渊、何轶榕;采样时间2019年8月16日。

2.2 分子系统发育分析

通过rDNA内转录间隔区的特异性扩增、序列比对、人工复检后,将序列输入NCBI数据库的blast工具中进行比对,发现本研究标本的序列与椰枣色孢鬼伞(Coprinusspadiceisporu)的序列(MW925041)相似度高达100%。采用最大似然法、贝叶斯分析法,基于内转录间隔区序列构建的标本与其近似种的系统发育树(图3)结果表明,本研究采集的标本与椰枣色孢鬼伞(Coprinusspadiceisporu)的序列(MW925041)聚在一起,最大似然法构建的系统发育树支持值为100,贝叶斯法构建的系统发育树支持值为1,并且与其他物种分开。

Coprinua nivea为雪白拟鬼伞;Coprinus cortinatus为丝膜拟鬼伞;Coprinus phlyctidosporus为多孢拟鬼伞;Coprinus atramentarius为墨汁鬼伞;Coprinus insignis为疣孢拟鬼伞;Coprinus cinereus为灰盖鬼伞;Coprinus picacea鹊拟鬼伞;Coprinus strossmayeri为施氏拟鬼伞;Coprinus spadiceisporus为椰枣色孢鬼伞;Coprinus comatus为毛头鬼伞;Coprinus sterquilinus为粪鬼伞;Clitocybe nebularis为烟云杯伞。

3 讨论与结论

经过形态学观察结合系统发育学鉴定,确定采自中国五台山的大型真菌标本为中国新记录种——椰枣色孢鬼伞(Coprinusspadiceisporus)。椰枣色孢鬼伞最初是由Bogart在1976年发现于美国华盛顿开阔林中地上,并将其描述为一个新种[26],同时基于Kiihner、Romagnesi[27]在1953年提出的系统分析法将该新种放入鬼伞属中。1997年Uljd、Noordeloos基于Singer[28]的研究,依据菌幕的特征将鬼伞属分为Coprinus(=AnnulatiJ.Lange)、Atramentarii(Fr.)Konr.&Maubl、AlachuaniSing、LanatuliSing这4个亚组。由于该物种存在菌环,且附着有菌丝状的菌幕,因此将其划分在Coprinus亚组中,同样属于Coprinus亚组的还有毛头鬼伞(C.comatus)、粪鬼伞(C.sterquilinus)。Bogart描述的椰枣色孢鬼伞在整体外观上与毛头鬼伞非常相似,主要区别在于后者子实体比较大,孢子、担子也比较大;粪鬼伞虽然生长在粪便上,但子实体、孢子都比较大。椰枣色孢鬼伞的主要特征是:子实体较小,只有3～5 cm;孢子(9.0～11.0)μm×(5.5～6.5)μm,担子(28.0～40.0)μm×(10.0～28.0)μm,具有4个孢子小梗,缘囊体(25.0～50.0)μm×(10.0～25.0)μm,有个别长达95 μm,无其他囊状体。本研究标本与来自北美洲的模式种、意大利记录的此物种相比,在菌盖大小、颜色等宏观形态上基本相同,在孢子、担子等微观形态上基本相似。区别在于,本研究标本的孢子、缘囊体略大于模式标本(北美洲模式标本的孢子为(8.1～10.0)μm×(6.2～6.9)μm,缘囊体为30.0 μm×43.0 μm;意大利记录此种的孢子为(6.7～9.3)μm×(5.3～6.8)μm,缘囊体为(30.0～65.0)μm×(15.0～23.0)μm,这与测量误差或环境因子有关。在生境上,本研究标本采自以杨属、栎属为主的阔叶林中地上,模式标本采自美国华盛顿的开阔林中地,意大利记录的此种采自鹿的粪便上,其生境基物的偏爱性有待进一步研究。

鬼伞属真菌适应性强,分布广泛,在生活中也较为常见。鬼伞属真菌的部分物种有着较高的食药用价值,例如毛头鬼伞(Coprinuscomatus),是世界著名的,集“天然、保健、营养”三机能为一体的珍稀食用菌,具有抗糖尿病的作用[29];墨汁鬼伞(C.atramentaria)据报道也具有较强的抗癌功效,未来可以应用于医疗等领域[30]。本研究中的椰枣色孢鬼伞(C.spadiceisporus)食药用价值尚不明确。本研究对我国鬼伞类真菌物种做了重要补充,为之后的研究提供了重要的科学依据。