腹泻病例中5 种致泻性大肠埃希菌的分子分型研究

王雪梅，张 苗

（淄博市疾病预防控制中心，山东淄博 255206）

大肠埃希氏菌是人体的正常菌群，后来人们发现某些大肠埃希菌可引起腹泻并在人群中流行，称为致泻大肠埃希菌（DiarrheagenicEscherichia coli，DEC）。20 世纪90 年代，DEC 被列为食品中致病菌之首[1]。根据携带毒力基因的不同，分为肠集聚黏附性大肠埃希菌（EnteroadherentEscherichia coli，EAEC）、肠道致病性大肠埃希菌（EnteropathogenicEscherichia coli，EPEC）、肠产毒性大肠埃希菌（EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）、 肠 道侵袭性大肠埃希菌（EnterinvasiveEscherichia coli，EIEC）和肠出血性大肠埃希菌（EnterohemorrhagicEscherichia coli，EHEC）[2]。脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）分子分型主要用于病原体的溯源研究，其原理是用琼脂块将细菌包埋，选取适合的内切酶进行酶切，使酶切片段在电泳中通过变换电场方向而得到良好的分离。本研究通过对腹泻人群分离的DEC 进行PFGE 分子分型，旨在了解腹泻患者DEC 感染的菌株间基因型联系和差异，为DEC 的防控及分子分型的数据库提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株为腹泻病例粪便中分离的DEC 92 株。PCR、PFGE 分别以5 种致泻大肠标准菌株和布伦登卢普沙门菌H9812 作为质控菌株。

麦康凯平板（北京路桥）；营养琼脂（北京路桥）；血琼脂平板（北京路桥）；核酸提取试剂盒（苏州天隆）；致泻性大肠埃希菌多重PCR 检测试剂盒（卓诚惠生）；全自动毛细管电泳试剂盒（卓诚惠生）；XbaI（TaKaRa 生物公司）。

1.2 仪器与设备

核 酸提 取 仪（NP968，苏 州 天 隆）；PCR 仪（Mastercycler gradient，eppendorf 公司）；多重食源性致病菌核酸检测系统（PathoMPSTM，凯杰公司）；恒温振荡水浴摇床（DSHZ-300A，太仓市实验设备厂）；脉冲场电泳仪（CHEF Mapper XA，Bio-Rad 公司）；凝胶成像系统（Gel Doc XR+，Bio-Rad 公司）。

1.3 实验方法

（1）将可疑DEC 划线麦康凯平板进行分离培养，挑取可疑菌落，划线营养琼脂后进行PCR 毒力基因检测，根据所携带的毒力基因进行型别鉴定。

（2）将菌落划线血琼脂平板，37 ℃培养14～18 h。将细菌均匀悬浮于配制好的CSB 中制成4.0 ～4.5 麦氏单位的菌悬液，加入20 mg·mL-1蛋白酶K 后加1%琼脂糖，待其凝固制成小胶块，水浴摇床150 r·min-1左右温育2 h。用无菌超纯水洗2 次，再用TE 缓冲液洗涤4 次。

（3）用内切酶XbaI Ⅰ对切成2 mm 的小胶块进行酶切，酶切时间至少2 h。将酶切后的胶块置于梳子上，倒入1%琼脂糖，冷却后放入电泳仪电泳19 h。

（4）将电泳后的胶块取出用GelRed 染液染色，纯水清洗后，凝胶成像仪获取图像，用 BioNumerics软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 患者发病年龄分布

0 ～12 岁患者检出15 例，占16.30%；13 ～44岁患者检出60 例，占65.22%；45 ～59 岁患者检出9 例，占9.78%；≥60 岁患者检出8 例，占8.70%，见表1。

表1 患者发病年龄分布

2.2 PFGE 分子分型

对92 株携带毒力基因的DEC 进行PFGE 分子分型，相似度最高为100%，最低的只有9.36%，主要结果见图1。

图1 部分DEC 分子分型结果

3 讨论?

据WHO 统计，全球每年约有20 亿感染性腹泻患者。感染性腹泻已成为全球性重要公共卫生问题，仅在2000 年腹泻引起的死亡报告数就达到210 万例[3]。DEC 是引起腹泻的主要病原菌之一，从腹泻患者中分离的比例呈上升趋势。有研究显示，DEC感染在细菌性感染腹泻中居首位[4]。

通过对DEC 患者进行年龄段分析，结果表明，13 ～44 岁患者DEC 的检出率较高，可能与该年龄段外出就餐频繁，同时对食品卫生重视程度不高有关，因此在加强食品监管的同时也要做好食品卫生安全的健康教育。本文研究结果与相关文献中的结果基本相符[5]，与河南省5 岁以下儿童为高发人群的结果不符[6]。

目前常用的分子分型技术主要有mPCR 技术、重复序列PCR 技术、PFGE 技术。mPCR 是在同一个反应体系中加入一对以上引物，分别扩增不同的模板，得到不同的目的片段[7]。重复序列PCR 技术是一种细菌基因组指纹分析方法，是扩增细菌基因组中的短重复序列，主要通过比较电泳条带，分析基因组间的差异[8]。PFGE 是PulseNet China 重要的病原菌分型技术，可实现全球监测结果的比对[9]。PFGE 是细菌分子分型技术的“金标准”，通过比较菌株之间PFGE 图谱条带分析菌株间同源性和相关性[10]。TALON 等[11]提出细菌条带相似度在85%以上为同源克隆菌株。运用PFGE 技术对腹泻病例中检出的DEC 菌株进行同源性分析，并对相关病例进行流行病学调查，判断是否发生流行，可提高疾病预警能力[12]。

本研究选取腹泻病人粪便中分离的大肠埃希氏菌，通过毛细管电泳仪检测其毒力基因，共检出DEC 92 株， 其 中EAEC 60 株、ETEC 20 株、EPEC 10 株，EHEC、EIEC 各1 株。此次检测发现，4 株ETEC 细菌条带的相似度为100%。其中3 株来自2017 年在同一医院就诊的3 名病例，1 株来自2016年在此医院就诊的病例。在不同时间不同患者中检出同一带型的ETEC，有报道称可能会存在部分菌株因其遗传特性比较稳定，在环境中长期存在[13]。另外，2 株来自同一病例携带不同毒力基因组合的EAEC，DNA 条带相似度为100%。检测的大多数菌株的条带相似度低于85%，说明由DEC 引起患者腹泻的菌株，其基因型存在多态性，以散发病例为主。

综上所述，通过对腹泻病例中分离的DEC 进行PFGE 分子分型，为DEC 病例的监测和控制提供参考数据，为深入研究DEC 分子多样性提供基础，为DEC 导致腹泻的分子流行病学研究提供依据，对暴发预警及溯源调查具有重要意义。