复方柿叶保健茶组方与保健功效的探究

梁慧

（梧州职业学院，广西 梧州 543000）

我国柿叶资源丰富，柿叶入药自我国明代至今均有记载。同时，柿叶也是我国民间保健品之一，古人以柿树叶为原料，参照茶叶制作工艺制成保健饮品。本研究选用恭城地区不同时期采收的水柿、月柿，并对其脱涩前后总黄酮、槲皮素、山奈素成分含量进行研究。并对柿叶与其他药物进行复方配伍，研究最佳配伍比例，并通过检测小鼠使用复方柿叶茶后体重、体脂数据，分析复方柿叶茶保健功效。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 主要仪器。SB25-12 DTDN型超声清洗机、万分之一电子分析天平、RE-52A 型旋转蒸发仪、SHB-3型循环多用真空泵、DZ-1BC型真空干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）、电磁炉、紫外分光光度计（Agilent CARY 6）Waters1525高效液相色谱仪（Waters2428紫外检测器），安捷伦extend-C18柱，微量注射器。

1.1.2 试剂。芦丁对照品（中国食品药品检定研究院 Z08YJ4K8/10080-202012）山奈酚对照品（中国食品药品检定研究院 Z08YJ4K9/10081-202102）。

1.1.3 试验样品。柿叶采集于广西壮族自治区恭城县，经广西中医药大学黄勇教授鉴定为柿树科柿树属植物柿的干燥叶。

1.1.4 实验动物。试验动物由梧州市食品药品检验所提供SPF级KM雄性小鼠，并饲喂于梧州市食品药品检验所动物实验室。

1.2 试验方法

1.2.1 柿叶采集与处理。2021年5月-9月，每15日采收一次，共采集10次。采摘的柿叶为从枝条顶端数进去第4-6片叶子（从上往下数），挑选质厚、无病虫害、无机械损伤的柿叶。冷水冲洗柿叶上的泥沙、杂质，剪去叶柄。在通风处风干，密封保存。另取鲜柿叶摊放4小时后用100℃开水杀青1分钟，摊凉后按加压“轻——重——轻”的原则揉捻约10min，每张柿叶搓揉成直径约2cm的茶粒，放至真空干燥箱干燥4h，检查剔除不合格品。

1.2.2 柿叶品质试验。

①测定柿叶样品总黄酮含量（三氯化铝比色法）[1]

精密称取AlCl3·6H2O2.42g，60%乙醇定容至100mL，配成0.1mol/mL的溶液。精密称取CH3COONa·3 H2O 2.72g，蒸馏水溶解至100mL，配成0.2mol/mL的溶液。精密量取1.15mL冰醋酸，蒸馏水溶解至100mL，配成0.2mol/mL的醋酸溶液。

精密称取于105℃下烘至恒重的芦丁对照品10mg，用60%（V/V）乙醇溶解，用60%乙醇定容至50mL容量瓶中，得芦丁标准溶液。精密量取芦丁标准溶液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL于25mL容量瓶中，各加入5.0mL 0.1mol/L AlCl3溶液及2.5mL 0.2mol/L的HAc－NaAc缓冲溶液（pH3.6），60%乙醇溶液定容，摇匀，40℃水浴中加热15min，冷却至室温，以0.1mol/mL AlCl3溶液为空白对照，420nm处测定吸光度值。以芦丁对照品浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程。

称取1.0g（准确至0.0001g）柿叶样品，倒入250mL三角瓶中，加入60%乙醇50mL，超声30min（超声温度 60℃）。过滤，60%乙醇定容至100mL，摇匀为样品液。吸取样品液1mL于25mL容量瓶中，加0.1mol/L AlCl3溶液5mL及2.5mL 0.2mol/L的HAc－NaAc缓冲溶液（pH3.6），60%乙醇溶液定容，摇匀，40℃水浴中加热15min，冷却至室温，以0.1mol/mL AlCl3溶液为空白对照，420nm处测定吸光度值。

类黄酮含量（mg/g）=查得黄酮含量（mg/g）×100×稀释倍数/样品干重（g）

②测定柿叶样品山奈素、槲皮素含量（HPLC法）[2,3]

色谱条件：C 18柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为甲醇－0.4%磷酸溶液（50∶50），流速1.0mL/min，检测波长360nm。

对照品、供试品和阴性溶液制备：精密称取槲皮素对照品、山柰素对照品适量，精密称定，加甲醇制成各含20μg/ml 的混合溶液，作为对照品溶液。

取总黄酮含量最高批次的柿叶粉末1.0g（过60目筛），精密称定，精密加甲醇－25%盐酸（4∶1）50ml，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用甲醇－25%盐酸（4∶1）补足减失的重量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。以甲醇溶液作为阴性对照溶液。

分别精密吸取槲皮素对照品溶液0.1mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL置10mL容量瓶中，各加甲醇至刻度，摇匀。分别进样20μL。以峰面积积分值为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，进行直线回归，得槲皮素回归方程。分别精密吸取山柰素对照品溶液（201.6μg/mL）0.1mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL置10mL容量瓶中，各加甲醇至刻度，摇匀，分别进样20μl。以峰面积积分值为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，进行直线回归，得山柰素回归方程。

1.2.3 组方试验。柿叶及西洋参、山楂叶、生地黄、生黄精、茯苓、野葛、五指毛桃、罗汉果分别粉碎，过5目筛，25目以下粉末筛去。柿叶及其他药物等比例混合，取以混合粉末5g，装入袋泡茶袋。把佛手含量、桔红含量、冲泡水量、冲泡时间作为影响柿叶茶滋味的因素，参照正交表L9（34）（表3）进行正交试验。组织5人评审小组，参照茶叶评审程序，从滋味、香气、汤色三方面对柿叶茶汤进行评价。选出最优配伍比例及冲泡方法。

1.2.4 动物试验。对完成组方配伍的柿叶茶，按组方和冲泡时间进行动物试验，以检验其保健作用。

实验动物饲喂及高血脂模型的建立：体重15g雄性KM小鼠70只，饲喂基础饲料，适应性喂养3天后记录体质量，剔除体质量异常小鼠。其余小鼠随机分为2组：空白对照组（n＝10），饲喂基础饲料；肥胖模型组，饲喂高脂饲料，期间小鼠自由摄食与饮水。

小鼠分组及给药灌胃：28天后测定各组小鼠体重和血糖值，剔除异常鼠后，将高血脂模型组小鼠随机分为肥胖模型组、阳性对照组、单方柿叶组以及复方柿叶保健茶高、中、低剂量组，每组10只。

肥胖模型建成后对受试小鼠进行灌胃处理，其中阳性对照组辛伐他汀的剂量为人体推荐量的20倍 即3.33mg/（kg·d mb），复方柿叶保健茶高、中、低剂量组（下文简称高剂量组、中剂量组、低剂量组）分别为人体推荐量的5、10、20倍，单方柿叶组剂量与复方柿叶保健茶组中剂量组相同。开始给药灌胃后每7天称一次小鼠体质量并记录；在实验第30天末次给药后，用颈椎脱臼法处死小鼠，测量各组小鼠体重、体长后，取肝脏测量肝脏质量，取腹腔脂肪及睾丸旁脂肪计算体脂率。

2 结果与分析讨论

2.1 不同时期、品种柿叶主要成分含量（见表1）

表1 不同时期、品种柿叶主要成分含量（mg/g）

2.2 组方配伍

由表2结果显示复方柿叶茶综合评价的主要影响因素依次为桔红含量、佛手含量、冲泡时间、冲泡水量。其中优水平组合为A2B3C3D1，即当柿叶茶采用柿叶及其他药物5g，冲泡水量750ml，冲泡时间5分钟时为较优水平。

表2 正交试验结果与分析

2.3 动物试验

由表3可知，小鼠平均体质量从大到小依次为中剂量组、高剂量组、模型组、阳性对照组、低剂量组、柿叶组、空白组。其中模型组、阳性对照组、低、中、高剂量组均与空白组具有统计学意义（P＜0.05）；小鼠lee's指数从高到低依次为中剂量组、空白组、模型组、高剂量组、低剂量组、阳性对照组、柿叶组。其中柿叶组小鼠lee's指数与空白组有明显差异（P＜0.05）；小鼠平均肝质量从大到小依次为模型组、中剂量组、剂量组、高剂量组、阳性对照组、柿叶组、空白组；小鼠肝脏指数从高到低依次为模型组、空白组、低剂量组、阳性对照组、中剂量组、高剂量组；小鼠腹腔脂肪湿重从大到小依次为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组、柿叶组、空白组。其中阳性对照组、柿叶组、中剂量组、高剂量组之间无明显差异。空白组、模型组、与其余各组间有明显差异；小鼠体脂率从高到低依次为模型组、低剂量组、柿叶组、中剂量组、阳性对照组、高剂量组、空白组。其中阳性对照组、柿叶组、中剂量组、高剂量组之间无明显差异。空白组、模型组、与其余各组间有明显差异。

表3 不同饲养方案对小鼠的影响

3 结论

水柿总黄酮含量高的采收时间为9月，槲皮素与山奈酚含量高的采收时间为7月；月柿总黄酮含量高的采收时间为8月，槲皮素与山奈酚含量高的采收时间为9月。

复方柿叶保健茶组方确定为柿叶、西洋参、山楂叶、生地黄、生黄精、茯苓、野葛、五指毛桃、罗汉果、佛手等量，加工工艺为以上各味粉碎过5目筛，25目以下粉末筛去，以5g以上粉末为度置茶叶袋中封口。饮用时以750ml开水冲泡5分钟，提出茶包，放至约45摄氏度或人体觉得温度适宜时饮用风味最佳。

复方柿叶保健茶能降低小鼠lee's指数、体脂率，对抑制肥胖进展和脂肪肝发展有一定保健作用。

4 推广与应用

此复方柿叶保健茶已于2021年广西职业教育成果展示周、2021年梧州地区职业教育成果展上进行展示和推广，得到了广大师生的好评。