FADV-4感染LMH细胞STING依赖的干扰素及细胞因子转录水平动态变化

李小凤,谢芝勋,阮志华,范 晴,谢志勤,武晓倩,韦 悠,张民秀,李 丹,万丽军,李 孟

(广西壮族自治区兽医研究所,广西兽医生物技术重点实验室/农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室,广西 南宁 530001)

血清4型禽腺病毒(fowl adenovirus serotype 4,FADV-4)是一种无囊膜的双链DNA病毒,主要感染3～6周龄肉鸡,诱发心包积液肝炎综合征(hydropericardium hepatitis syndrome,HHS)[1],其发病迅猛,传播途径广,致死率高,制约着我国家禽业的发展[2]。

FADV-4病毒可以入侵鸡大部分器官,但病变主要发生在心脏、肝脏、肾脏,并诱发严重的炎症反应,导致细胞凋亡,组织坏死[3-4]。关于FADV-4致病机制研究较少。当病毒入侵宿主时,宿主的天然免疫系统其特有的模式识别受体(patterns recognition receptors,PPRS)识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAM-Ps),触发细胞内信号级联反应,诱导Ⅰ型干扰素(INF)、细胞因子产生建立防护屏障保护宿主[5-6]。DNA模式识别受体是一种新型模式识别受体,其中一种是由环鸟苷-腺苷二磷酸合成酶(cGAS)/干扰素刺激基因(STING)介导,识别病毒双链DNA(dsDNA)[7]。当病毒入侵机体时,cGAS结合病毒dsDNA,激活干扰素刺激基因STING[8-9]。STING蛋白构像发生变化,结合2′,3′-cGAMP,招募TANK连接酶(TBK1)[10-11],使TBK1磷酸化,为干扰素调节因子7(IRF7)提供结合平台,促使Ⅰ干扰素和细胞因子表达,从而抑制病毒复制[12]。FADV-4感染LMH细胞,由STING依赖的干扰素及细胞因子变化情况还不明确。监测FADV-4感染LMH细胞病毒后不同时间点STING介导信号通路识别受体及其下游干扰素、细胞因子转录水平动态变化,分析其变化规律,进一步了解FADV-4的致病机制和免疫机理。

1 材料与方法

1.1 病毒与细胞FADV-4与鸡肝癌细胞(LMH)均由广西壮族自治区兽医研究所生物技术重点实验室保存。

1.2 主要试剂DMEM/F12细胞培养基(批号:8122171)、胎牛血清(FBS,批号:WXBD8944V),购自美国赛默飞世尔科技公司;Universal Genomic DNA Kit(批号:18221),购自北京康为世纪生物科技公司;Gene JET RNA Purification Kit(批号:00968689)、2×SYBR Green Master Mix(批号:91302107),购自美国英杰生命技术公司;Prime Script RT Master Mix(批号:AL12412A),购自宝日医生物技术(北京)公司产品。

1.3 主要仪器超微量分光光度计(型号为NanoDrop2000)、实时荧光定量PCR仪(型号为Quant Studio 5),购自美国赛默飞世尔科技公司产品;倒置荧光显微镜(型号为ECLIPSETi2-U),购自日本Nikon公司。

1.4 FADV-4感染LMH细胞及样品收集LMH细胞按1×106个/mL接种于6孔细胞培养板,培养24 h,弃掉培养基,接种FAdV-4病毒液稀释液(1∶500)0.5 mL,对照组接种等量的PBS,作用1～2 h,后每孔补加1.5 mL的培养基。以24 h为1个时间点,每个时间点观察细胞病变情况并收集细胞样品,连续培养至120 h。

1.5 LMH细胞的病毒载量测定参照Universal Genomic DNA Kit的抽提试剂盒提供的方法进行病毒DNA抽提,NanoDrop2000测定质量浓度后将病毒DNA定量为100 mg/L,进行绝对实时荧光定量PCR,扩增体系(总体积为20 μL):2×SYBR Green Mix 10 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL(引物信息见表1 FADV-4),DNA模板 2 μL,RNasefree水6 μL。扩增程序:50℃激活2 min,95℃预变性2 min,95℃变性15 s,60℃退火1 min,60℃延伸1 min,共40个循环。每个样品重复3次。结果按照前期实验室建立的标准曲线计算[13]。

1.6 STING依赖的干扰素及细胞因子表达量的测定参照Gene JET RNA Purification Kit抽提试剂盒说明书进行RNA抽提,超微量分光光度计测定浓度,进行一步法反转录,反转录反应体系(总体积为20 μL):5×PrimeScript RT Master Mix 4 μL,RNA 1 μg,无核酸酶水补至20 μL。反转录反应程序:37℃ 15 min,85℃ 5 s。以得到的cDNA稀释10倍后作为模板进行相对实时荧光定量PCR,实时荧光定量PCR扩增体系和程序同1.5所述。检测STING、TBK1、IRF7、INF-α、INF-β、IL-6、IL-8、IL-1β的转录水平,以β-actin为内参基因,引物信息见表1[14]。

1.7 数据的统计分析将获得的FADV-4基因的扩增循环数值(Ct)后,代入已建好的标准曲线,计算细胞内病毒拷贝数。通过将获得的试验组与对照组目的基因,β-actin的Ct值,代入2-ΔΔCt公式计算相对转录水平,计算公示为:△Ct(试验组)=Ct(试验组目的基因)-Ct(试验组内参基因);△Ct(对照组)=Ct(对照组目的基因)-Ct(对照组内参基因),△△Ct=△Ct(试验组)-△Ct(对照组),表达量的差异倍数使用2-ΔΔCt。利用IBM SPSS Statistics 2.0软件对数据进行Studentt差异性分析,*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著P<0.01。采用Prism8软件制图。

表1 荧光定量PCR引物序列

2 结果

2.1 FAdV-4感染LMH细胞后病变和病毒复制情况FAdV-4感染LMH细胞,24 h后初露病变迹象,48 h后小部分细胞变圆、变亮;72 h后细胞聚集,间隙增大,病变较为明显;96～120 h细胞出现大量脱落、破裂、死亡,细胞内部有被侵蚀现象(图1)。为明确LMH细胞中FAdV-4病毒复制情况,采用实时荧光定量PCR测定不同时间点的病毒拷贝数,结果发现,FAdV-4病毒感染LMH细胞后,病毒拷贝数整体趋势是先增加后减少,在48 h前快速增加,72 h达到最大值,拷贝数为9.13×1010copies/μL,96～120 h出现下降趋势(图2)。

图1 FADV-4感染LMH细胞的病变图片(×100 μm )

图2 FADV-4感染LMH细胞后不同时间点的病毒载量

2.2 FAdV-4感染LMH细胞后STING依赖的干扰素及细胞因子表达量动态变化为了明确FAdV-4感染LMH细胞后STING依赖的干扰素及细胞因子表达量动态变化。实时荧光定量PCR方法测定STING、TBK1、IRF7、INF-α、INF-β、IL-6、IL-8、IL-1β在不同时间点的表达量。以未接毒组为对照组,β-actin为内参基因,所测定的这8种基因表达量呈现规律性变化。STING感染后表达量与对照组的相比,24 h先出现下调,之后上调,72 h 显著上调(P<0.05),96～120 h极显著上调,在96 h达到上调高峰(19.23倍,P<0.01)(图3A)。TBK1感染后表达量与对照组的相比,24～48 h显著上调(P<0.05),72 h轻微下调,随后持续下调,96～120 h显著下调(P<0.05),趋于平稳(图3B)。IRF7感染后表达量与对照组相比,24 h先上调,48 h 反而轻微下调,72～120 h后持续上调,在96～120 h 出现极显著上调且在120 h达到上调高峰(12.02倍,P<0.01)(图3C)。Ⅰ型干扰素INF-α、INF-β和细胞因子IL-6、IL-8感染后表达量与对照组的相比,均呈现较大幅度的上调。INF-α表达量在24～120 h连续上调,在72～120 h极显著上调(P<0.01),到120 h上调44.30倍(P<0.01)(图3D)。INF-β表达量变化趋势是先上升后下降,96 h 达到上调高峰(63.85倍,P<0.01)(图3E)。IL-6表达量变化趋势与INF-α的相似,在所检测时间点连续上调,在96～120 h极显著上调(P<0.01),120 h上调达到89.23倍(P<0.01)(图3F)。IL-8表达量在24～96 h 持续上调,72～120 h达到极显著上调(P<0.01),96 h出现峰值(75.34倍,P<0.01),120 h出现下调趋势(图3G)。炎症因子IL-1β表达量在感染24～72 h降低(P<0.05),72～120 h有升高趋势,这可能是降低LMH细胞受FADV-4伤害的一种方式(图3H)。

*.差异显著(P<0.05);**.差异极显著(P<0.01)

3 讨论

天然免疫细胞的模式识别受体特异性识别病原体,促进干扰素和细胞因子表达,诱发一系列“自我防卫”,其中STING介导的信号通路是抗病毒的重要环节之一。FAdV-4不仅感染肉鸡、蛋鸡、种鸡[15-16],且在鸭子、鹅,鸽子、鸳鸯等动物发现[17-19],其病程短、致死率高,造成养殖业巨大的经济损失。因此,监测FAdV-4感染LMH细胞后STING依赖的干扰素及细胞因子表达量动态变化,为进一步研究FADV-4致病机制奠定试验基础。结果表明,STING、TBK1、IRF7、INF-α、INF-β、IL-6、IL-8的表达量均出现不同程度的上调,干扰素INF-α、INF-β及细胞因子IL-6、IL-8的表达量上调较为显著。提示STING-TBK1-IRF7介导的信号通路受体诱导Ⅰ型干扰素和细胞因子表达,在应答FADV-4感染LMH细胞中发挥重要作用。

STING是DNA信号通路的一个关键接头蛋白,位于内质网,在免疫系统作为枢纽蛋白,发挥信号传递,启动天然免疫功能[20-21]。已有研究表明,当病原体核酸暴露于细胞质,STING被激活,形成二聚体,开始膜运输,经过高尔基体最终到达细胞核周围,其C端尾部(CTT)打开呈线性化,连接TBK1,同时TBK1被磷酸化,并为IRF7提供结合平台,使其磷酸化,激活下游的干扰素和炎性因子上调表达。本试验中,通过实时荧光定量PCR技术分析发现,FADV-4感染LMH细胞后,STING、TBK1、IRF7表达量出现不同程度的上调。STING在感染24 h出现轻微下调,后上调,在96 h达到19.23倍(P<0.01),分析STING表达量在24 h下调原因可能是LMH细胞天然免疫系统识别到FADV-4的入侵时被活化,形成二聚体,之后表达量上调,在72 h显著上调,此时的FADV-4的病毒达到增殖高峰(9.13×1010copies/μL),96～120 h病毒载量出现下降趋势,病毒复制拷贝数从9.13×1010copies/μL下降到9.03×1010copies/μL,STING的转录水平维持在一个较高水平,表明STING与病毒复制有一定正相关性。TBK1的转录水平在感染24～48 h 显著上调,72 h轻微下调,保持在一个相对稳定的数值,分析下调原因可能是当天然免疫系统被激活时,TBK1被STING磷酸化,其以磷酸化形式(PTBK1)存在。IRF7表达量在感染后,先上调后下调,再持续上调,在120 h出现峰值,暗示随着FADV-4快速增殖,IRF7开始与FADV-4病毒作较量,抑制病毒复制。STING、IRF7表达量平升高与LI[22]在感染FADV-4的鸡身上研究的结果一致。以上提示,STING介导的信号通路受体在FADV-4感染LMH细胞后,48 h前可能是识别过程,随着感染时间延长病毒复制拷贝数增加,STING-TBK1-IRF7介导的信号通路积极参与调控LMH细胞的免疫应答。

STING介导的信号通路诱导细胞因子和Ⅰ型干扰素表达抗病毒已经得到证实。INF-α、INF-β属于常见的Ⅰ型干扰素,是免疫调节和抗病毒感染的重要因子。INF-α和INF-β在感染后72 h剧烈上调,INF-α在120 h出现峰值(44.30倍),INF-β在感染后96 h达到上调高峰(63.85倍)。IL-6是一种典型的功能性多效性细胞因子,在宿主防御中发挥重要作用。当感染或组织损伤发生时,IL-6由单核细胞和巨噬细胞迅速产生,有帮助清除感染因子和修复受损组织作用[23]。IL-8是趋化因子家族的成员,介导局部炎症有关的免疫应答辅助抗体生成。IL-6、IL-8表达量在感染72 h后与对照组的相比出现剧烈的上调,上调高峰分别为89.23,75.34倍,研究结果与NIU等[24]的研究一致。FADV-4感染LMH细胞后,病毒在48 h前快速复制,72 h病毒复制拷贝数最高,INF-α、INF-β、IL-6、IL-8在感染后24～72 h呈上升趋势,在72 h时上升倍数从高到低分别为IL-8(32.80倍)、INF-β(19.76倍)、IL-6(15.52倍)、INF-α(14.84倍)。表明IL-8是抗感染的主要免疫因子。72 h正是病毒感染的高峰期,病毒迅速入侵细胞内部,侵害细胞,使细胞聚集,间隙增大,破裂,导致细胞对营养物质吸收降低,进而导致细胞死亡。96～120 h期间,FADV-4在LMH细胞中呈下降趋势,大量细胞死亡。INF-α、IL-6依然处于上升趋势,INF-β、IL-8呈现下降趋势,在120 h时,INF-α、INF-β、IL-6、IL-8表达量从高到低分别为IL-6(89.23)、IL-8(57.38)、INF-α(44.30)、INF-β(42.60)。表明在感染后期,IL-6是主要的抗感染的细胞因子,这与其帮助清除感染因子和修复受损组织作用相一致[23]。猜测FADV-4的病毒载量下降原因有2个:一是INF-α、INF-β、IL-6、IL-8起到了抗病毒复制的作用;二是LMH细胞在感染后期,细胞大量死亡病毒失去了宿主,失去营养物质的来源,导致下降。这有待进一步研究。炎症因子IL-1β感染后先降低后升高,可能是通过降低其表达量减少病毒对LMH细胞的损伤利于病毒复制,后升高是抑制病毒复制。FADV-4感染LMH细胞后,72 h增殖出现高峰后下降,可能是因为LMH细胞免疫应答被激发后INF-α、INF-β、IL-6、IL-8表达量升高,协同抑制FADV-4的复制。提示INF-α、INF-β、IL-6、IL-8在抗FADV-4感染LMH细胞发挥重要作用。

在FADV-4感染LMH细胞后,STING介导的信号通路识别受体,诱导细胞因子和干扰素上调表达,提高免疫应答,抑制FADV-4病毒复制、增殖。这些结果丰富了宿主抵抗FADV-4感染天然免疫应答机理的研究。