甘草多糖抗妊娠期暴露代森锰锌致断乳仔鼠肾损伤的作用

孙雨昕,温 冉,宫新城,2,史万玉,2,王晓丹,2*

(1河北农业大学 中兽医学院,河北 保定 071000;2河北省兽医生物技术创新中心,河北 保定 071000)

代森锰锌(mancozeb,MCZ)是一种代森锰和锌离子结合的用于控制真菌植物病原体的杀菌剂,广泛用于保护蔬菜、水果以及观赏植物和高尔夫球场等,MCZ可通过抑制丙酮酸的氧化起到杀菌作用[1],因其低毒性、广谱抑菌性[2]、还能为植物补充微量元素锌在农作物种植中被广泛使用,但是MCZ在土壤中持久存在,在水中迅速分解导致其易残留的特性。2021年1月欧盟终止了MCZ的许可证,原因是其具有一些典型的人类致癌物质特性[3]。MCZ作为内分泌干扰物[4],诱导氧化应激,导致人类和动物的精子发生和生殖器官出现异常[5],改变肾脏中的总谷胱甘肽酶活性,导致铜在肾脏中积累,改变机体内的金属稳态[6]。重金属积累可以在怀孕期间转移到胎儿和哺乳期间转移到子代身上,对人体有致癌、影响胚胎着床[7]等从而影响本代及子代生长发育的危害潜力。甘草自古以来就是我国应用广泛的一种中草药,又名“国老”,具有良好的药用和食用价值,有补中益气、解毒止痛等的效用。甘草多糖(glycyrrhiza polysaccharide,GP)是从甘草中提取的水溶性多糖,作为甘草主要的活性成分之一,具有增强免疫活性[8]、抗氧化[9]、抗凋亡、抗肿瘤[10]等多种生物活性,对于MCZ的毒性有一定的缓解作用[11]。为此,本试验初步探索GP对妊娠期暴露MCZ诱导子代小鼠肾脏损伤的缓解作用,为更多中药的开发与应用提供一定的科学解释。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器MCZ(商品级Dithane-M45,80%)、GP(GP,30%)购自西安圣青生物科技有限公司;EastepTMSuper 总RNA 提取试剂盒(LS1040,promega,北京);HiScript®Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(R323-01,维诺赞生物,南京);TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(RR820A,TaKaRa,China);引物(大连宝生物有限公司);总蛋白定量、T-AOC、MDA、SOD、GSH-Px试剂盒(南京建成生物工程研究所,南京);GPX4、FSP1、TGF-β1试剂盒(酶联生物,上海)。

1.2 动物分组及处理方法选用SPF级未经产的7周龄雌性和雄性昆明小鼠分笼适应性饲养1周后,下午8:00合笼饲养,早上8:00检查有无阴栓,检出阴栓者定为孕0 d,并将孕鼠换笼饲养。将孕鼠随机分为空白对照组、MCZ组、GP低剂量组、GP中剂量组、GP高剂量组,共5组,每组10只。空白对照组早晚各灌服1次0.1 mL生理盐水;MCZ对照组早上灌服150 mg/kg的MCZ,晚上灌服0.1 mL 生理盐水;GP低剂量组早上灌服150 mg/kg 的MCZ,晚上灌服50 mg/kgGP;GP中剂量组早上灌服150 mg/kg的MCZ,晚上灌服100 mg/kg GP;GP高剂量组每天早上灌服150 mg/kg 的MCZ,晚上灌服200 mg/kg GP,仔鼠产后与母鼠同窝喂养,泌乳期不饲喂母鼠MCZ,在仔鼠21 d 时将其处死。本研究中动物处理过程通过河北农业大学实验动物伦理委员会的动物伦理学审查。

1.3 指标测定

1.3.121 d仔鼠体质量及肾脏指数测定 称取21 d 仔鼠体质量,断颈处死后剖开腹腔取出肾脏,记录不同组仔鼠肾脏质量。肾脏指数=肾脏质量(g)/体质量(g)×100%。

1.3.221 d仔鼠肾脏组织形态观察 将新鲜21 d仔鼠肾脏置于4%多聚甲醛溶液中固定备用,常规制备5 μm厚石蜡切片, HE染色后置于光学显微镜下观察21 d仔鼠肾脏组织形态变化情况。

1.3.321 d仔鼠血清中肌酐、尿素氮含量测定 将21 d仔鼠血液以3 000 r/min离心,取上清并分装保存于-20℃待用。按照南京建成生物工程研究所尿素氮试剂盒及肌酐试剂盒说明书要求测定21 d仔鼠血清中肌酐和尿素氮含量。

1.3.421 d仔鼠肾脏组织匀浆中T-AOC、SOD、GSH-Px、MDA含量测定 取21 d仔鼠肾脏,按说明书制备10%组织匀浆,提取其上清液,分装保存于-20℃待测。取组织匀浆上清液,按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书分别测定肾脏组织中T-AOC、SOD、GSH-Px、MDA含量。

1.3.521 d仔鼠肾脏组织匀浆中FSP1、TGF-β1、GPX4含量测定 取21 d仔鼠肾脏按说明书制备10%组织匀浆,提取其上清液,分装保存于-20℃待测。取10%组织匀浆上清液,按照ELISA试剂盒说明书分别测定肾脏组织匀浆中FSP1、TGF-β1、GPX4含量。

1.3.621 d仔鼠肾脏组织中NOX4、NF-κB p65 mRNA、GPX4转录水平测定 用EastepTMSuper 总RNA 提取试剂盒提取21 d仔鼠肾脏中总RNA,再用HiScript®Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)试剂进行RNA的逆转录合成cDNA,分装保存于-20℃,待用。用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)等试剂采用实时荧光定量PCR法对目的基因NOX4、NF-κB p65 mRNA、GPX4表达水平进行检测,PCR过程引物由大连宝生物有限公司设计合成,引物设计如表1,循环:采用95℃ 30 s 预变形;95℃ 5 s 变性,60℃ 30 s退火,39个循环。以β-actin为内参,用2-△△Ct表示目的基因的相对表达量。

1.3.7数据统计 应用Excel软件整合数据,SPSS软件进行单因素方差分析,Graphpad Prism 9.0软件绘制图形,差异比较通过One-way ANOVA进行评估。

表1 引物序列信息

2 结果

2.1 GP对妊娠期暴露MCZ的21 d仔鼠肾脏组织形态的影响HE染色结果,如图1所示,空白对照组,肾小球大小正常,边缘界限清晰,肾小管上皮细胞排列整齐,管腔大小正常;与MCZ组相比,GP中剂量组肾小囊囊腔变大,肾小管结构较清晰,无大量肾小管上皮细胞脱落;GP高剂量组肾小球形状较正常,肾小囊囊腔结构较清晰,管腔大小较正常,无大量肾小管上皮细胞脱落。

2.2 GP对妊娠期暴露MCZ的21 d仔鼠体质量及肾脏指数的影响如图2A所示,在体质量方面,体质量与MCZ的剂量呈“U”型关系,MCZ组与空白对照组相比下降,且差异极显著(P<0.01),用GP与MCZ联合处理后,GP低剂量组差异显著(P<0.05);如图2B所示,在肾脏指数方面,MCZ组与空白对照组相比上升,但差异不显著(P>0.05),用GP与MCZ联合处理后GP中、高剂量组均低于MCZ组,且差异均极显著(P<0.01)。

2.3 GP对妊娠期暴露MCZ的21 d仔鼠血清中肌酐、尿素氮的影响如图3A所示,在肌酐方面,MCZ组与空白对照组相比上升,且差异均极显著(P<0.01),用GP与MCZ联合处理后均低于MCZ组,且GP中、高剂量组差异均极显著(P<0.01);如图3B所示,在尿素氮方面,MCZ组与空白对照组相比上升,且差异显著(P<0.05),用GP与MCZ联合处理后均低于MCZ组,且GP高剂量组差异极显著(P<0.01)。

K.空白对照组;M.MCZ组;D.GP低剂量组;Z.GP中剂量组;G.GP高剂量组;*.MCZ组与空白对照组相比差异显著(P<0.05);**.MCZ组与空白对照组相比差异极显著(P<0.01);#.GP低、中、高剂量组与MCZ组相比差异显著(P<0.05);##.GP低、中、高剂量组与MCZ组相比差异极显著(P<0.01)。下同

图3 GP对妊娠期暴露MCZ的21 d仔鼠肌酐和尿素氮的影响

2.4 GP对妊娠期暴露MCZ的21 d仔鼠肾脏组织中T-AOC、SOD、GSH-Px、MDA水平的影响如图4A所示,在T-AOC方面,MCZ组与空白对照组相比差异不显著(P>0.05),用GP与MCZ联合处理后,GP中、高剂量组与MCZ组相比差异显著(P<0.05);如图4B所示,在SOD活力方面,SOD活力与GP的剂量呈 “U”型关系,MCZ组与空白对照组相比差异不显著(P>0.05),用GP与MCZ联合处理后,差异也不显著(P>0.05);如图4C所示,在GSH-Px方面,GSH-Px与GP的剂量呈倒“U”型关系,MCZ组与空白对照组相比差异极显著下降(P<0.01),用GP与MCZ联合处理后,GP中剂量组与MCZ组差异显著(P<0.05);如图4D所示,在MDA方面,MDA与GP的剂量呈倒“U”型关系,MCZ组与空白对照组相比上升,且差异极显著(P<0.01),用GP与MCZ联合处理后均低于MCZ组,且GP中剂量组差异显著(P<0.05),GP低、高剂量组差异极显著(P<0.01)。

图4 GP对妊娠期暴露MCZ的21 d仔鼠T-AOC、SOD、GSH-Px 、MDA水平的影响

2.5 GP对妊娠期暴露MCZ的21 d仔鼠肾脏组织中FSP1、TGF-β1、GPX4蛋白相对含量的影响如图5A所示,在FSP1蛋白方面, FSP1蛋白与GP的剂量呈倒“U”型关系,MCZ组与空白对照组相比差异不显著(P>0.05),用GP与MCZ联合处理后,GP中剂量组与MCZ组相比差异显著(P<0.05);如图5B所示,在TGF-β1蛋白方面,MCZ组与空白对照组相比差异不显著(P>0.05),用GP与MCZ联合处理后,GP中剂量与MCZ组相比差异显著(P<0.05),GP高剂量组与MCZ组相比差异极显著(P<0.01);如图5C所示,在GPX4蛋白方面,GPX4蛋白与GP的剂量呈倒“U”型关系,MCZ组与空白对照组相比差异不显著(P>0.05),用GP与MCZ联合处理后,GP低、中剂量组与MCZ组相比差异极显著(P<0.01)。

2.6 GP对妊娠期暴露MCZ的21 d仔鼠肾脏组织中GPX4、NF-κB p65、NOX4 mRNA相对表达量的影响如图6A所示,在GPX4 mRNA相对表达量方面,MCZ组与空白对照组相比下降,但差异不显著(P>0.05),用GP与MCZ联合处理后均高于MCZ组,且GP高剂量组差异极显著(P<0.01);如图6B所示,在NOX4 mRNA相对表达量方面,NOX4 mRNA相对表达量与GP的剂量呈 “U”型关系,MCZ组与空白对照组相比差异极显著(P<0.01),用GP与MCZ联合处理后均低于MCZ组,且GP低、中、高剂量组与MCZ组相比差异均极显著(P<0.01);如图6C所示,在NF-κB p65 mRNA相对表达量方面,NF-κB p65 mRNA相对表达量与GP的剂量呈 “U”型关系,MCZ组与空白对照组相比上升,且差异极显著(P<0.01),用GP与MCZ联合处理后均低于MCZ组,且GP低、中、高剂量组与MCZ组相比差异均极显著(P<0.01)。

图5 GP对妊娠期暴露MCZ的21 d仔鼠FSP1、TGF-β1、GPX4蛋白质量浓度的影响

图6 GP对妊娠期暴露MCZ的21 d仔鼠GPX4、NOX4 、NF-κB p65 mRNA相对表达量的影响

3 讨论

MCZ对肾脏的特异性作用机制尚未完全清楚,但已有中度至高度的可信度[12]的体内试验数据表明MCZ会通过细胞水平影响小鼠胚胎生殖发育[13]应被视为生殖毒物,长期暴露在MCZ环境下,可能引起帕金森等神经退行性疾病[14],引起机体脂质过氧化和活性氧的形成,从而诱导产生氧化应激状态[15]。体外试验表明MCZ能通过ERK信号通路引起PC-12细胞神经元凋亡[16],调控各种氧化应激相关蛋白及转录因子的变化,引起细胞氧化应激导致DNA损伤[17]。MCZ暴露除影响本代接触者的健康外,MCZ还能通过血-胎盘和血-乳屏障[18]影响到子代的健康。本试验通过建立孕鼠妊娠期MCZ暴露模型,探究GP对MCZ暴露导致的子代断乳雌鼠的肾脏损伤的缓解机制。

氧化应激是机体内氧化系统和抗氧化系统的平衡被打破的一种机能障碍状态,机体本身会维持自身氧化还原状态的平衡,但受到一定的有害刺激时会表现出活性氧自由基的积累,刺激机体,使机体氧化应激失衡。肾脏对氧化应激高度敏感[19],肌酐[20]、尿素氮水平作为肾功能生物标志物,被广泛用于判断肾损伤程度的指标,试验表明,与MCZ组相比,GP高剂量组(200 mg/kg)极显著缓解了21 d仔鼠的肾损伤程度(P<0.01),且呈剂量依赖关系。GSH-Px和SOD作为自由基清除剂,其含量与机体抗氧化能力呈正比;MDA作为脂质过氧化反应的终产物,反应机体的过氧化程度;GP对活性氧中的自由基具有较强的清除还原能力[21],从而提高机体的抗氧化能力。研究发现,GP能显著提高注射新城疫疫苗的鸡血清中的T-AOC、GSH-Px和SOD含量,降低脂质过氧化物MDA含量,从而提高机体的抗氧化能力[22]。本试验表明,与MCZ组相比,GP中剂量组(100 mg/kg)显著提高了21 d仔鼠血清中T-AOC和GSH-Px活力(P<0.05),显著降低了MDA含量(P<0.05),但对SOD含量的影响并不显著(P>0.05),且并不完全呈剂量依赖关系,这可能是因为21 d仔鼠受到母乳的影响而对于部分有害刺激的变化水平影响较小有关。

铁死亡是一种非凋亡形式的细胞死亡,具有铁依赖性、脂质过氧化物及活性氧积累的特征,在肾脏疾病中起着重要影响[23]。研究表明,铁死亡与许多炎症疾病[24]、神经退行性疾病[25]、肿瘤[26]等有关。NOX4是NADPH氧化酶,主要在肾脏组织中表达,且对活性氧含量敏感[27];核转录因子NF-κB是炎症过程中的关键调控因子,炎症反应在肾脏纤维化中起着关键作用[28]; FSP1和GPX4是调控细胞死亡的关键靶点, GPX4能引起过氧化物的积累,减轻肾小管上皮细胞死亡,从而抑制小鼠死亡[29]; TGF-β1是转化生长因子超家族的多肽成员,包括调控细胞生长、分化和凋亡等多种过程[30]的双向调节因子,在炎性环境中发挥抗炎作用,而TGF-β1的过度生产又反而会导致细胞损伤,进而导致组织纤维化的产生,研究表明,铁死亡可以抑制慢性肾损伤的进展[31]。本试验表明,与MCZ组相比,GP组(50,100,200 mg/kg)均极显著抑制MCZ带来的NOX4 mRNA、NF-κB p65 mRNA转录水平的升高(P<0.01),GP中剂量组(100 mg/kg)显著抑制MCZ带来的FSP1、GPX4及TGF-β1蛋白水平的降低(P<0.05),GP高剂量组(200 mg/kg)极显著抑制MCZ带来的GPX4 mRNA水平的降低(P<0.01),从而降低21 d仔鼠肾脏炎症程度、活性氧积累、纤维化程度,从而增强机体对铁死亡的耐受性。

综上所述,GP通过提高21 d仔鼠的抗氧化应激能力和对铁死亡的耐受力而减轻肾损伤对机体带来的影响,但并不完全呈剂量依赖性,其中以中剂量的GP组(100 mg/kg)对21 d仔鼠的肾脏保护作用最明显。