妊娠期糖尿病患者不同孕期肠道微生物和代谢产物水平变化与胰岛素抵抗的关系

祝淑平，马丽，叶晓林，顾俊菲

妊娠期糖尿病（GDM）为孕期常见并发症，胰岛素抵抗（IR）为其主要病理机制。GDM 可显著增加羊水过多、妊娠期高血压、产后糖尿病、新生儿窒息、巨大儿的发生风险，影响母婴结局［1-2］。加强对GDM患者孕期IR 的研究是临床研究重点［3-4］。机体的免疫失常及炎症反应均与IR 有一定关系［5］，而肠道菌群在能量调节、炎症反应及免疫功能调节中具有重要作用。正常情况下，肠道菌群与机体互利共生，肠道微生物呈平衡状态［6］。在妊娠期间，孕妇生理变化相对显著，随着孕周的增加，机体肠道菌群亦随之出现改变［7-8］。有研究认为，孕早期肠道菌群构成与未妊娠的健康女性相似，至孕晚期变形菌及放线菌门整体丰度呈增加趋势，但个体丰度降低，孕晚期具有抗炎活性的粪便杆菌丰度亦降低［9］。另有研究提出，GDM 患者血糖异常与肠道微生物群厚壁菌、拟杆菌、放线菌门丰度改变有关，且孕妇体内微生物亦会对妊娠结局产生影响［10］。本研究对GDM 患者肠道微生物及代谢产物进行分析，探讨其与孕妇IR的关系，为临床控制GDM进展提供客观依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2018 年7 月—2021 年7 月在安徽医科大学附属安庆市第一人民医院进行产检并计划在本院生产的120 例GDM 孕妇为研究对象。年龄18～41 岁，平均年龄（29.56±4.33）岁。GDM诊断标准：孕前无糖尿病史，口服75 g葡萄糖耐量试验（OGTT）空腹血糖（FBG）＞5.1 mmol/L 或餐后1 h血糖＞10.0 mmol/L或餐后2 h血糖＞8.5 mmol/L［11］。纳入标准：（1）GDM患者入组时孕周≤12周。（2）本地常住居民。（3）单胎妊娠。排除标准：（1）先兆流产保胎者。（2）合并凝血功能异常者。（3）合并胃肠道疾病、肝肾功能不全、甲状腺疾病、慢性高血压等疾病者。（4）有家族遗传病史者。本研究经伦理委员会批准（批准号：KYLL-2018-051），并获得所有患者知情同意。

1.2 观察指标

1.2.1 肠道微生物检测 分别于孕早期（1～12 周）、孕中期（13～27周）、孕晚期（28～40周）采集受试者粪便中段样本，置入粪便收集管中，-80 ℃保存待检。应用16S rRNA法测定样本中生物菌群分布情况，在室温下解冻，并提取标本中DNA，行PCR 扩增。引物515 上游：5'-GTGYCAAGCMGCCGCCGTAA-3'，806下游：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAA-3'，产物大小290 bp。纯化扩增产物后应用美国Illumina 公司的HiSeq2500 PE250测序，并将结果输入GenBank 中进行对比。微生物检测种类包括拟杆菌属、普氏菌属、另枝菌属、栖粪杆菌属、考拉杆菌属、毛螺菌属、副杆菌属、布劳特氏菌属、厚壁菌属、放线菌属。

1.2.2 肠道微生物代谢产物检测 采用液相色谱-串联质谱法检测粪便样本中氧化三甲胺（TMAO）及相关代谢产物［左旋肉碱、氯化胆碱、甜菜碱、三甲胺（TMA）］。

1.2.3 IR 相关指标检测 采用稳态模型计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）和稳态模型评估β细胞功能指数（HOMA-β）：HOMA-IR=空腹胰岛素（FINS）（mU/L）×FPG（mmol/L）/22.5；HOMA-β=20×FINS（mU/L）［/FPG（mmol/L）-3.5］［12］。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0 软件处理数据，无序分类资料采用χ2检验，计量资料以表示，组内计量资料比较采用配对样本t检验，组间计量资料比较采用独立样本t检验，多组间计量资料比较采用方差分析，多重比较采用LSD-t检验，肠道微生物及代谢产物与IR 指标相关性采用Pearson 相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同孕期的肠道微生物丰度变化 各孕期GDM患者普氏菌属、另枝菌属、考拉杆菌属、毛螺菌属、副杆菌属、布劳特氏菌属丰度比较差异无统计学意义（P＞0.05）。孕早、中、晚期肠道拟杆菌属、栖粪杆菌属丰度依次降低，厚壁菌属、放线菌属丰度依次升高（P＜0.05），见表1。

Tab.1 Comparison of gut microbes between different trimesters of pregnancy表1 不同孕期的肠道微生物丰度比较（n=120，%，）

Tab.1 Comparison of gut microbes between different trimesters of pregnancy表1 不同孕期的肠道微生物丰度比较（n=120，%，）

＊＊P＜0.01；a与孕早期比较，b与孕中期比较，P＜0.05。

孕期孕早期孕中期孕晚期F拟杆菌属35.25±3.64 27.58±3.14a 25.69±5.24ab 182.485＊＊普氏菌属6.11±0.63 6.12±0.78 6.19±0.81 0.412另枝菌属2.43±0.22 2.46±0.28 2.47±0.39 0.094栖粪杆菌属11.69±1.42 9.71±0.98a 6.75±0.71ab 639.242＊＊考拉杆菌属8.47±0.85 8.66±0.87 8.59±0.82 1.545孕期孕早期孕中期孕晚期F毛螺菌属4.83±0.45 4.87±0.52 4.92±0.71 0.749副杆菌属1.13±0.12 1.12±0.17 1.15±0.18 1.110布劳特氏菌属0.35±0.07 0.34±0.07 0.33±0.07 2.449厚壁菌属2.36±0.45 3.16±0.38a 4.17±0.48ab 513.03＊＊放线菌属9.05±2.01 10.36±1.58a 13.26±1.54ab 187.583＊＊

2.2 不同孕期肠道微生物代谢产物水平比较 不同孕期左旋肉碱、氯化胆碱、甜菜碱水平比较差异无统计学意义（P＞0.05），孕早、中、晚期GDM 患者肠道TMAO 和TMA 水平依次升高（P＜0.05），见表2。

Tab.2 Comparison of metabolites between different trimesters of pregnancy表2 不同孕期肠道微生物代谢产物水平比较（n=120，mmol/L，）

Tab.2 Comparison of metabolites between different trimesters of pregnancy表2 不同孕期肠道微生物代谢产物水平比较（n=120，mmol/L，）

＊＊P＜0.01；a与孕早期比较，b与孕中期比较，P＜0.05。

孕期孕早期孕中期孕晚期F TMAO 8.26±2.35 10.58±2.71a 12.36±2.54ab 78.768＊＊TMA 181.23±19.58 234.16±30.15a 297.41±30.29ab 551.159＊＊左旋肉碱122.36±25.29 120.54±27.21 127.36±26.57 2.152氯化胆碱113.26±25.87 120.37±25.69 119.64±29.33 2.515甜菜碱225.36±37.21 226.47±38.45 231.36±35.47 0.890

2.3 不同孕期胰岛素抵抗水平分析 孕早、中、晚期GDM 患者HOMA-IR 依次升高，HOMA-β 依次下降（P＜0.05），见表3。

Tab.3 Comparison of insulin resistance between different trimesters of pregnancy表3 不同孕期胰岛素抵抗水平比较（n=120，）

Tab.3 Comparison of insulin resistance between different trimesters of pregnancy表3 不同孕期胰岛素抵抗水平比较（n=120，）

＊＊P＜0.01；a与孕早期比较，b与孕中期比较，P＜0.05。

孕期孕早期孕中期孕晚期F HOMA-IR 1.25±0.23 1.69±0.17a 3.58±0.39ab 2 358.598＊＊HOMA-β 67.25±7.19 36.54±5.44a 21.36±3.58ab 2 090.892＊＊

2.4 孕晚期肠道微生物及代谢产物与IR 的相关性 孕晚期拟杆菌属、栖粪杆菌属与HOMA-IR 呈负相关（r 分别为-0.564、-0.617，均P＜0.05），与HOMA-β 呈正相关（r分别为0.378、0.475，均P＜0.05）；厚壁菌属、放线菌属、TMAO、TMA 与HOMAIR 呈正相关（r分别为0.425、0.417、0.681、0.526，均P＜0.05），与HOMA-β 呈负相关（r分别为-0.621、-0.395、-0.533、-0.647，均P＜0.05）。

3 讨论

IR 为妊娠期代谢系统常见生理性变化，随着孕周的增大，机体中雌激素和孕激素的增加可拮抗胰岛素，并降低机体靶器官对胰岛素的敏感性。在正常情况下，机体可代偿性分泌胰岛素控制血糖水平，而GDM患者无法分泌足量胰岛素控制血糖水平，出现糖脂代谢紊乱，诱发IR，而IR 亦会加重糖脂代谢紊乱，形成恶性循环，危害母婴安全［13-14］。近年来研究发现，肠道菌群失调会加重机体糖脂代谢紊乱，加重糖尿病病情［15-16］，但较少研究分析肠道菌群与IR的关系。

肠道菌群失调后，机体会快速吸收脂肪酸及葡萄糖，促进脂肪细胞因子大量分泌，刺激免疫系统、诱导分解代谢途径均会增加体质量，加重糖尿病症状，糖脂代谢异常亦会在一定程度上影响机体肠道菌群平衡［17］。肠道菌落种类较多，在消化系统中功效不尽相同，厚壁杆菌、栖粪杆菌、放线菌、拟杆菌是肠道中相对优势的细菌。本研究对不同孕期肠道菌群微生物进行分析发现，孕早、中、晚期肠道的拟杆菌属、栖粪杆菌属丰度依次降低，厚壁菌属、放线菌属丰度依次升高，提示随着孕周的增加，GDM 孕妇肠道菌群失调越发严重。分析可能是因为厚壁杆菌、放线菌产生的丁酸盐细菌无法被宿主吸收，其水平越低，宿主吸收能力越强，而在GDM孕妇中，糖脂代谢异常亦会影响机体吸收能力，因此厚壁杆菌、放线菌水平升高［18］。栖粪杆菌可有效维持肠黏膜屏障完整性，机体在出现肠道功能紊乱时，其水平亦显著降低［19］。拟杆菌参与多糖、类固醇、胆汁酸的代谢，还可维持肠道正常生理，但GDM孕妇糖脂代谢异常则会进一步影响多糖、类固醇、胆汁酸的代谢，降低拟杆菌水平［20］。放线菌可产生各种活性物质，改善肠道上皮屏障功能，因此在机体肠道功能受损后，其水平降低［21］。但在本研究中呈升高趋势，可能受到环境、研究对象肠道功能影响，对此需扩大样本量进行验证。

TMAO、TMA为肠源性菌群代谢产物，肠道中部分菌群可产生TMA 裂解酶，将饮食中摄入的肉类碱、甜菜碱、胆碱转化为TMA，经黄素单加氧酶氧化生成TMAO，调节蛋白质稳定性及活性，TMAO、TMA水平的高低亦可在一定程度上反映机体肠道功能［22］。本研究发现，孕早、中、晚期GDM 患者肠道TMAO、TMA 水平依次升高，提示随着孕期增加，GDM 孕妇肠道微生物代谢产物亦出现异常。分析可能是因为GDM在出现肠道菌群失调后，肠道上皮细胞间紧密性降低，导致肠道渗透性增加，肠道菌群及代谢产物则从肠腔转移至循环系统，加重病情，而作为肠源性菌群代谢产物的TMAO、TMA 水平在菌群失调后亦受到影响［6］。本研究还发现，孕早、中、晚期GDM 患者HOMA-IR 依次升高，HOMA-β 依次下降；同时孕晚期肠道内拟杆菌属、栖粪杆菌属与HOMA-IR 呈负相关，与HOMA-β呈正相关；厚壁菌属、放线菌属、TMAO、TMA 与HOMA-IR 呈正相关，与HOMA-β呈负相关，提示机体中肠道微生物及代谢产物水平与GDM 孕妇IR 存在一定关系。分析原因可能是机体中肠道菌群失调影响了代谢产物的合成及代谢，机体中肠道屏障亦受损，增加局部肠道渗透性，加重炎症反应，诱发代谢紊乱，进一步诱导内质网钙库中细胞内钙动员，刺激内质网应激，而内质网应激则可通过钙依赖蛋白激酶Ⅱ激活c-Jun 氨基末端激酶（JNK），JNK水平升高亦可促进胰岛素受体底物丝氨酸磷酸化，降低机体蛋白激酶B 磷酸化水平，抑制机体中胰岛素信号传导，加重IR［23-24］。

综上所述，随着孕期进展，GDM 孕妇肠道微生物及代谢产物水平紊乱会增加GDM 孕妇发生IR 风险。但本研究不足之处在于研究例数较少，得出结论或可存在偏差，因此还需扩大样本量进行验证。