榧树的花粉活力检测及短期贮藏条件

黄东晨，任晓亮，马小民，黄 铖，王 飞，蒲哨峰，傅松玲

（1. 安徽农业大学，安徽 合肥 230036；2. 舒城县棠树乡林业站，安徽 六安 231300；3. 安徽徽宝农林科技有限公司，安徽 六安 231300）

榧树Torreya grandis为中国特有树种，雌雄异株，稀同株，寿命长，抗性强，树形及材性好，在安徽省皖南山区与大别山区天然分布较多，种质资源丰富[1-3]。目前人工栽培果用的主要为榧树的雌性优良品种香榧Torreya grandis‘Merrillii’[4]，其在授粉期间需要大量的优质榧树花粉。榧树授粉期一般在4—5月，皖南和大别山区雨水较多，且香榧的开花时间不等，花期不遇和花粉遇水失活现象较为严重[5-6]。目前国内对榧树的研究多集中在表型资源[7]、基因遗传[8]等方面，忽视了对榧树花粉的筛选、保存贮藏方面的研究。花粉既是生物有效的信息传递，也是植物代代相传的延续手段[9]，花粉活力的强弱筛选、保存贮藏对于植物尤其是类似榧树这种雌雄异株植物的花期不遇、杂交育种、人工授粉等起到关键性作用[10-11]。前人研究证实不同的榧树花粉对香榧的榧籽、榧核的形态特征存在花粉直感现象[12]；张辉[13]通过香榧控制授粉杂交种子理化性质的分析证实父本榧树、母本香榧及其交互作用对香榧种子均有显著影响，有必要开展父本榧树选育。那么不同表型榧树的花粉活力检测、短期贮藏是否存在一定的异同点？基于此，本研究利用TTC 染色法并通过隶属函数法综合评价得出榧树花粉通用适宜的花粉活力检测条件，并分析不同榧树花粉活力随干燥方式、温度和贮藏时间的贮藏变化规律，为榧树花粉的筛选、活力快速检测、贮藏及开展人工杂交授粉、雄榧优良单株选育等研究提供理论参考。

1 研究区概况

榧树花粉来源于安徽省六安市舒城县安徽徽宝农林科技有限公司的山七镇三石村（31°10′N，116°40′E）香榧扶贫基地。试验林位于北亚热带湿润气候区，年平均气温16.3 ℃，极端最低温度-12 ℃，年平均降水量780 mm，无霜期可达272 d。土壤为黄壤、黄红壤，pH 值为5.8 ～6.5，呈微酸性。

2 材料与方法

2.1 试验材料

2021年4月，采集6 株不同表型的榧树（依据散粉期和球花大小来划分）花粉，分别记作YC1（中早期花常规型，4.5 cm ＜花蕾横径＜5.5 cm）、YD2（晚期花大型，花蕾横径＞5.5 cm）、YX3（早期花小型，花蕾横径＜4.5 cm）、YD4（中晚期花大型，花蕾横径＞5.5 cm）、YX5（中期花小型，花蕾横径＜4.5 cm）、YC6（中期花常规型，4.5 cm ＜花蕾横径＜5.5 cm）。2022年由于疫情及过度修剪，仅采集到YD2、YX3、YC6 这3 种榧树的花粉。

2.2 研究方法

2.2.1 适宜花粉活力检测方法的筛选

花粉活力检测采用常规TTC 染色法[14]测定。2021年采用TTC 质量分数（A）、温度（B）、pH值（C）三因素完全区组实验设计，研究6 个不同表型榧树花粉活力快速检测的适宜方法。其中TTC质量分数设3个水平，分别为A1（0.2%）、A2（0.5%）、A3（0.8%）；温度设置3个水平，分别记作B1（25 ℃）、B2（28 ℃）、B3（30 ℃）；pH 值设置C1（pH 值6.0）、C2（pH 值6.5）、C3（pH 值7.0）、C4（pH 值7.5）、C5（pH 值8.0）5 个水平；共计45 个试验处理。每处理重复2 次，观察时每重复制片选取3 个视野，每视野花粉总数＞100 个。花粉培养6 h 后，将载玻片从培养箱中取出，在光学显微镜（Primo Star，ZEISS）低倍镜(10×10 倍)下观察染色花粉。其中有活力的花粉为染成红色的花粉，淡红色为活力较弱，无色的花粉则为无活力花粉。

花粉活力=（视野内染色花粉数/视野内花粉总数）×100%。

2.2.2 短期贮藏与干燥方式

2022年采集新鲜的花粉，选择室内阴干干燥（W1）、烘箱28 ℃干燥（W2）和硅胶常温干燥（W3）3 种不同的干燥方式对其进行干燥24 h，同时以新鲜花粉作为对照处理。检测干燥后的花粉活力，每个处理进行4 次重复，每重复制片选取3 个视野。

花粉短期贮藏活力仍用TTC 染色法检验，由于新鲜花粉在自然条件下7 d 内花粉失活现象严重，故试验过程中仅比较不同干燥方式条件（W1、W2、W3）下的花粉短期贮藏活力。干燥后装入离心管中，用医用注射器抽真空，将不同榧树的花粉分别置于室温28、4、0、-18 ℃进行贮藏，每隔7 d 检测一次花粉活力，每处理重复3 次，每重复制片选取2 个视野。

2.3 数据处理

运用ImageJ 软件进行花粉统计计数，用Microsoft Office Excel 2016 软件录入数据， 用SPSS 23.0 软件对试验数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA）、三因素方差分析和多重比较（LSD 法，P＜0.05）；采用隶属函数法[15]对不同因素处理组不同表现型榧树花粉活力进行综合评价。采用SigmaPlot 14.0 软件作图。

3 结果与分析

3.1 花粉活力检测

3.1.1 不同TTC 质量分数、温度、pH 值对花粉活力检测效果的影响

不同表型的榧树花粉随染色条件的不同而呈现不同的染色结果（图1）。所有表型单株的花粉活力表现在0.8%TTC 下花粉活力与0.2%、0.5%TTC 下花粉活力差异显著（图1）。表型YX3、YC6 花粉在TTC 质量分数为0.5%时平均花粉活力达到最高，分别为（67.45±2.67）%和（85.00±0.58）%。在高质量分数下，TTC 染料更易沉积在花粉中，相比较低质量分数染色效果较差，更易造成视觉误差。在3 个温度条件下，YC1、YX5、YC6 的花粉活力值接近，未达到差异显著水平（图1）。YD2、YX3 与YD4 在28 ℃时平均花粉活力达到最高，染色表现较好。在偏酸性环境（pH 值6.0、6.5）下，单株的花粉活力最低，染色效果较差（图1）。而在中性环境（pH值7.0）下和偏碱性环境（pH 值7.5、8.0）下，除YD2、YX3 在中性环境染色效果不明显外，各单株平均花粉活力均大于70%，染色效果较偏酸性明显。

图1 不同处理对不同榧树花粉活力的影响Fig. 1 Effects of different TTC concentrations on the pollen viability of Torreya grandis

3.1.2 最适花粉活力染色组合的筛选

TTC 质量分数、pH 值、温度以及交互作用对花粉活力检测均有差异显著影响（表1）。采用隶属函数法进行最适花粉活力染色组合的筛选，对各单株的45 个处理的平均隶属函数值按照从大到小的顺序进行排序，结果见表2。表2 表明，各单株隶属函数排名前10 组的处理组合各不相同，其中不同的TTC 质量分数中A2水平出现了26 次，占总组合的43.33%；不同的温度处理中B2和B3水平均占35.00%，其次是B1水平，占30.00%；不同的pH 值中C5水平占据了25.00%，其次是C2和C4，分别占总组合的23.33%和20.00%。统计所有的因素组合发现A2B2C5、A3B1C5、A2B3C1这3个组合在各单株隶属函数排名前10的占比最高，为6.67%，结合前面各水平出现的频率和呈现的花粉染色效果、花粉活力情况，综合得出A2B2C5为最适花粉活力染色组合，且更适用于较早期或较晚期散粉类型。

表2 不同因素组合对不同榧树单株的隶属函数评价†Table 2 Membership function evaluation of different combinations of factors on different Torreya grandis individuals

3.2 花粉短期贮藏

3.2.1 不同干燥方式对花粉活力的影响

干燥一定程度上能降低榧树花粉的活力（图2）。表型YX3 和YC6 榧树在烘箱28 ℃干燥24 h条件下花粉活力达到最高，分别为（93.42±0.89）%、（90.48±0.67）%，与其他2 种干燥方式均达到差异显著水平。表型YD2 单株则呈现出不同的趋势，室内阴干干燥（W1）24 h 条件下花粉活力最高，与烘箱28 ℃干燥（W2）、硅胶常温干燥（W3）2种方式差异显著，烘箱28 ℃干燥情况下花粉的活力比室内阴干干燥花粉降低了16.50%，硅胶常温干燥条件下比室内阴干干燥花粉降低了36.93%。

图2 不同干燥方式干燥后的单株花粉活力Fig. 2 The pollen viability of the single plant after drying by different drying methods

3.2.2 不同贮藏条件下榧树花粉活力的变化趋势

表3 表明，除干燥方式与时间的交互作用未达到差异显著水平外，干燥方式、时间、温度以及交互作用对不同表型榧树的花粉活力影响均达到极显著差异水平，综合表明3 个因素对榧树的花粉贮藏活力均有较大影响。花粉活力随着贮藏天数的增加而不断降低（图3）。表型YD2 单株同其他两株相比花粉活力整体偏低，在3 种干燥方式下，仅烘箱28 ℃干燥条件下贮藏21 d 以上花粉活力能保持在20%～30%范围，且不同温度间差异显著（图3B），室内阴干干燥（W1）14 d 能维持在40%左右（图3A），硅胶常温干燥（W3）不利于短期贮藏（图3C）。表型YX3 和YC6 单株在不同的干燥方式下随着贮藏天数的增加其花粉活力降低趋势明显，室内阴干干燥条件下常温保存效果较差，-18 ℃贮藏35 d 花粉活力仍能保持35%以上（图3D、G）；烘箱28 ℃干燥（W2）条件下常温和4 ℃开始能维持较高水平，但在7 ～14 d 后花粉活力骤降为零，0 ℃与-18 ℃下花粉活力贮藏效果明显，尤其是YC6 贮藏35 d 仍能维持40%以上（图3E、H）；硅胶常温干燥条件下YX3 在4 ℃下花粉活力贮藏35 d 内效果较佳（图3F），YC6 在室温与0 ℃下花粉活力贮藏35 d 能维持25%以上（图3I）。

表3 不同贮藏条件下榧树花粉活力的方差分析Table 3 Analysis of variance of the pollen viability of Torreya grandis under different storage conditions

图3 3 个榧树花粉活力的变化趋势Fig. 3 Trends in the pollen viability of three Torreya grandis

4 讨 论

榧树作为裸子植物，其花粉在离体萌发时速度缓慢，条件要求严格，通过预试验发现离体培养效果不显著，36 h 内无明显萌发现象，故在研究时采用TTC 染色法。经染色发现榧树能够呈现较好的染色效果，可能是由于榧树个体花粉外壁厚度适宜和人工营造的环境便于染色剂进入的缘故[16]。适宜的质量分数能产生较好的染色效果，本研究发现不同榧树在进行快速检测时以TTC 质量分数0.5%染色效果较佳，这点同任文玲等[17]的研究结果一致。温度是影响花粉活力的关键因素，适宜的温度有利于花粉的交流与传递，有研究发现杏Prunus armeniaca花粉功能对环境条件高度敏感，花粉萌发等生殖性状可能更适合与低温共存，这也符合杏是早花型树种的特性[18]。本研究中温度在30 ℃时的榧树花粉染色效果明显不及28 ℃，可能是由于温度较高时会影响榧树花粉的酶活性，呼吸作用减弱，染色效果不明显，也可能与榧树的花期多在4月有关。不同植株花粉对于不同的pH 值环境适应性不同，有研究表示pH值水平与杉木Cunnighamia lanceolata花粉的萌发和花粉管生长呈正相关关系[19]。任少华等[20]研究香榧花粉活体检测认为pH 值偏高，易在载玻片上出现染料沉积的现象进而影响测试结果，可以选择30 ℃、pH 值7.0 快速得出鉴定结果，与本研究结果不太一致，可能是由于不同的榧树花粉活力的适宜测定方式不同，但综合来看，0.5%TTC、28 ℃与pH 值8.0 为比较通用适宜的检测方式，3 种因素及其交互作用对花粉活力的测定结果均具有显著影响。榧树在微碱性环境下染色效果较佳，没有明显的染料沉积，便于区分，对于晚期花粉更为明显，可能是由于榧树花粉本身和不同地理环境的差异[21]，或是由于与质量分数、温度相互影响的结果。

花粉干燥主要是对花粉含水量产生影响，通过减少含水量从而延长花粉的贮藏时间，花粉干燥后减缓了花粉的呼吸作用，减少营养消耗，避免花粉暴露在外界环境下脱水死亡[22]。本研究发现早、中期榧树花粉在烘箱干燥28 ℃条件下仍能保持较高的花粉活力，而晚期类型YD2 在3 种干燥方式下干燥效果均不佳，这可能与以下几个原因有关：晚期花粉散粉期间外界温度已经较高，影响植物本身的花粉活力，晚期发展的孢子与同花期早、中期发展的孢子相比，花粉质量较差[23]；晚期花粉内源激素同早、晚期花粉激素含量不同，所呈现出的调控结果不一致，从而间接导致花粉活力的降低[24]；或是植株花粉在运输过程中造成一定的损失，影响花粉得率从而导致花粉活力下降[7]。本研究仅探究了3 种干燥条件下的花粉活力，对于干燥时间、含水量等导致花粉活力变化、贮藏效果的影响仍有待进一步研究。

花粉贮藏对于植物花期不遇、种质资源保存等具有重大意义，不同的干燥方式、贮藏温度与贮藏时间能够影响花粉的贮藏活力。本研究表明，干燥方式、贮藏温度与贮藏时间以及交互作用对花粉贮藏活力存在显著影响，不同贮藏条件下不同榧树的花粉活力不同，可能是由于不同表型的榧树花粉脱水后耐性不同，也可能与本身的个体差异有关[25-26]。早期类型YX3 和中期类型YC6 短期贮藏在烘箱28 ℃干燥24 h 后在0 ℃或-18 ℃贮藏7 ～14 d，超过30 d 采取室内干燥24 h 后在-18 ℃贮藏，花粉活力能保持在35%以上，这是由于花粉在干燥后再进行低温贮藏，内在的部分水分脱去，花粉的代谢生理与呼吸作用减缓，花粉活力降低的速度减缓[27]，这点类似于果实低温贮藏的作用机理，延缓了内源物质的急速下降[28]。但随着贮藏天数的增加，长期的低温不能较好地保持酶活性，花粉活力会随之降低[29]，也可能是花粉内源碳水化合物含量的降低，造成渗透外壁的糖蛋白丢失[30]。硅胶干燥花粉贮藏效果同室内干燥差异不显著，随着贮藏时间的增加，其贮藏效果越差，可能是硅胶干燥并不能满足榧树花粉贮藏时含水量的需求范围，以致于后期花粉贮藏过程中的生理活动较强，贮藏活力下降。

5 结 论

榧树的花粉活力宜采用0.5%TTC、25 ℃、pH值8.0 的方式进行快速测定；早、中期散粉型花粉贮藏宜采取恒温（28 ℃）干燥24 h 后在0 ℃或-18 ℃贮藏7 ～14 d；储藏期超过30 d 需先室内阴干干燥24 h后置于-18 ℃贮藏；晚熟花粉不宜贮藏，应使用新鲜花粉。实际生产中应结合当地的花期早晚进行花粉贮藏方式的选择，人工授粉时宜选择相应时间段活力较强的花粉，并且在一周内完成，避免造成不必要的损失。本研究结果对于榧树花粉的筛选、检测、干燥及贮藏、优株选择有重大意义，但关于花粉表型、物候期与花粉活力的内在联系仍需后期进行研究和探讨。