天麻素经IRE1α/TRAF2/NF-κB通路调控大鼠急性心肌梗死诱导的炎性反应及机制研究

李小玲 钟小兰 方志敏 刘顺民 刘兆平

急性心肌梗死(acute myocardial infraction,AMI)是临床常见的心血管疾病危重症之一,具有发病突然、病死率高的特点,当前经皮冠状动脉形成术及血管紧张素转换酶抑制剂等药物的应用有效降低了AMI患者病死率[1]。但心肌细胞是一种终末分化细胞,死亡后不可再生,而AMI后心肌组织释放多种自身抗原,导致机体自身免疫反应,诱发一系列炎性反应,对心肌细胞产生负性作用,引起心功能进行性障碍,最终影响患者预后并增加患者猝死风险。因此,寻找缓解AMI所致炎性反应的有效药物或靶点是医药研究工作者的重要课题[2-4]。天麻素(gastrodin)是提取自中药兰科天麻属植物天麻块茎的主要有效成分,具有抗菌、抗炎、抗氧化等广泛的药理作用[5]。Liu等[6]研究显示,天麻素可抑制动脉粥样硬化小鼠早期炎性反应。杨伟等[7]研究报道,天麻素可通过抑制炎性反应和氧化应激减轻心脏缺血再灌注损伤,但天麻素作用于AMI的效果及作用机制尚不清楚。因此,本研究制备AMI大鼠模型,探究天麻素对AMI诱导的炎性反应的影响并探讨其相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 清洁级雄性SD大鼠,6～8周龄,体重180～200 g[新疆医科大学实验动物中心,实验动物许可证号:SCXK(新)2018-0002]。置于恒温25℃动物房分笼饲养,12 h明暗交替,自由进食、饮水。天麻素(纯度≥98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);戊巴比妥钠(上海思域化工科技有限公司);肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(武汉华美生物工程有限公司);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenytetrazolium chloride,TTC)染色试剂盒、苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司);RIPA裂解液、BCA试剂盒(上海碧云天生物技术研究所);兔抗肌醇依赖性激酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE1α),磷酸化IRE1α(p-IRE1α)、肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor associated factor 2,TRAF2)、p65、磷酸化p65(p-p65)抗体、鼠抗β-actin抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG二抗(美国Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及AMI模型制备:50只SD大鼠适应性喂养1周后,随机分为假手术(Sham)组、模型(AMI)组、天麻素低剂量(L-GAD)组、天麻素高剂量(H-GAD)组、卡托普利(CAP)组,每组10只。除Sham组外,其他4组大鼠参照文献[8]建立AMI大鼠模型。腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠,仰卧位固定于手术台上,气管插管连接呼吸机后行开胸术,采用6-0无菌丝线在左心耳下1～1.5 mm处结扎冠状动脉左前降支,左室前壁心肌颜色由鲜红色变为苍白色即为结扎成功,清理胸腔后关闭胸腔,逐层缝合。术后24 h大鼠心电图可见ST段呈弓形向上型抬高,表示造模成功。Sham组大鼠同上述操作,仅穿线不结扎冠状动脉。术后5组大鼠均使用10万U青霉素抗感染,连续3 d。

1.2.2 药物处理:术后24 h 造模成功后,L-GAD、H-GAD组大鼠分别按照50 mg/kg、100 mg/kg剂量尾静脉注射给药,CAP组大鼠尾静脉注射6.25 mg/kg卡托普利,AMI组和Sham组大鼠尾静脉注射相同剂量0.9%氯化钠溶液,1次/d,连续给药4周后取大鼠组织标本进行检测。

1.2.3 超声心动图检测大鼠心功能变化情况:术后4周末,麻醉大鼠,进行心脏超声检测,记录左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、收缩末期左心室内径(left ventricular end-systolic diameter,LVDs)、舒张末期左心室内径(left ventricular end-diastolic diameter,LVDd)。

1.2.4 组织标本收集:术后4周末,5组大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉,采用腹主动脉采血法处死大鼠,抽取的血液置于冰盒30 min后,在4℃条件下,3 500 r/min离心10 min,取上清液,分装至1.5 ml的EP管,-80℃保存备用。摘取大鼠心脏,置于4℃ 0.9%氯化钠溶液浸泡,用无菌医用纱布吸去多余水分,在心脏最大横颈部位小心切开心脏,部分心肌组织置于4 %多聚甲醛溶液中固定24 h,随后进行组织脱水、透明、石蜡包埋等操作,制备石蜡切片,另一部分心肌组织装入冻存管,置于液氮保存备用。

1.2.5 TTC染色评估大鼠心肌梗死面积比:取冻存的大鼠心肌组织,用磷酸缓冲盐(PBS)溶液清洗后,将心肌组织切成5片冠状切片,将切片置于1%的TTC染液中,37℃避光孵育20 min,随后在4%多聚甲醛中固定24 h,拍照观察,正常心肌区域呈现红色,梗死区域呈现白色,计算心肌梗死面积比,梗死面积比=梗死区域面积/切面总面积×100%。

1.2.6 HE染色观察大鼠心肌组织病理形态学变化情况:取5组石蜡切片,脱蜡后用苏木精染色10 min,自来水冲洗后,用1%的盐酸乙醇溶液分化1 min,自来水洗涤后,再用伊红染色3 min,冲洗后,将组织切片用不同浓度的乙醇逐级脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,置于显微镜下观察大鼠心肌组织病理形态学变化。

1.2.7 ELISA法检测大鼠血清中TNF-α、IL-6、MCP-1含量:取5组保存备用的大鼠血清,按照ELISA试剂盒说明书检测大鼠血清中TNF-α、IL-6、MCP-1对应的吸光度(OD)值,在提前绘制的标准曲线上根据样本OD值查出相应浓度,计算TNF-α、IL-6、MCP-1含量。

1.2.8 qRT-PCR检测大鼠心肌组织中TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA表达水平:取5组大鼠心肌组织,加入Trizol试剂提取组织总RNA,紫外分光光度法测定总RNA得纯度和浓度,将RNA反转录合成cDNA,根据实时荧光定量PCR试剂盒说明书配置qRT-PCR实验反应体系,进行PCR扩增。反应条件:95℃ 15 min,95℃ 15 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,共进行40个循环,以GAPDH为内参基因,采用2-ΔΔCt定量方法计算目的基因相对表达量。见表1。

表1 引物序列

1.2.9 Western blot法检测大鼠心肌组织中IRE1α/TRAF2/NF-κB通路蛋白表达情况:取冻存的心肌组织,加入RIPA裂解液提取组织总蛋白,按照BCA试剂盒说明书检测蛋白浓度,经SDS-PAGE电泳分离蛋白后转移至PVDF膜上,5 %脱脂牛奶中室温封闭1 h,加入IRE1α(1∶1 000)、p-IRE1α(1∶1 000)、TRAF2(1∶1 000)、p65(1∶1 000)、p-p65(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)一抗,4 ℃孵育过夜,洗涤后加入HRP标记的二抗(1∶2 000),室温孵育2 h,经化学发光法显影后,以β-actin作为内参蛋白,使用凝胶成像分析软件分析蛋白条带灰度值。

2 结果

2.1 天麻素对大鼠心功能及心肌梗死面积比的影响 Sham组大鼠心功能参数正常,未见心肌梗死;与Sham组比较,AMI组大鼠心功能参数LVEF显著降低,LVDs和LVDd显著升高,且存在明显的心肌梗死,差异均有统计学意义(P<0.05);与AMI组比较,L-GAD、H-GAD组和CAP组大鼠心功能参数LVEF均显著升高,LVDs和LVDd均显著降低,且心肌梗死面积比均显著减小,差异均有统计学意义(P<0.05);H-GAD组和CAP组大鼠心功能参数LVEF、LVDs、LVDd及心肌梗死面积比变化程度与L-GAD组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2,图1。

表2 天麻素对大鼠心功能及心肌梗死面积比的影响 n=10,

图1 天麻素对大鼠心肌梗死面积比的影响(TTC染色检测大鼠心肌梗死面积比)

2.2 天麻素对大鼠心肌组织病理形态学变化的影响 Sham组心肌细胞排列整齐、核结构正常,细胞形态未见明显异常;AMI组大鼠心肌细胞排列紊乱,细胞着色不均,发生大量变性、坏死,心肌纤维肿胀、断裂,可见大量炎性细胞浸润;与AMI组比较,L-GAD、H-GAD组和CAP组大鼠心肌组织损伤明显减轻,炎性细胞浸润明显减少,且H-GAD组和CAP组大鼠心肌组织损伤改善较L-GAD组更为显著。见图2。

2.3 天麻素对大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-1含量的影响 与Sham组比较,AMI组大鼠血清中TNF-α、IL-6、MCP-1水平显著升高(P<0.05);与AMI组比较,L-GAD、H-GAD组和CAP组大鼠血清中TNF-α、IL-6、MCP-1水平显著降低(P<0.05),且H-GAD组和CAP组大鼠血清中TNF-α、IL-6、MCP-1水平较L-GAD组降低更为明显(P<0.05)。见表3。

图2 天麻素对大鼠心肌组织病理形态学变化的影响(HE×400)

表3 天麻素对大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-1含量的影响 n=10,pg/ml,

2.4 天麻素对大鼠心肌组织中TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA表达的影响 与Sham组比较,AMI组大鼠心肌组织中TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA表达量显著升高(P<0.05);与AMI组比较,L-GAD、H-GAD组和CAP组大鼠心肌组织中TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA表达量显著降低(P<0.05),且H-GAD组和CAP组大鼠心肌组织中TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA表达量较L-GAD组降低更为明显(P<0.05)。见表4。

表4 天麻素对大鼠心肌组织中TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA表达的影响 n=10,pg/ml,

2.5 天麻素对大鼠心肌组织IRE1α/TRAF2/NF-κB通路蛋白表达的影响 与Sham组比较,AMI组大鼠心肌组织中TRAF2蛋白表达量、p-IRE1α/IRE1α和p-p65/p65比值均显著升高(P<0.05);与AMI组比较,L-GAD和H-GAD组大鼠心肌组织中TRAF2蛋白表达量、p-IRE1α/IRE1α和p-p65/p65比值均显著降低(P<0.05),且H-GAD组大鼠心肌组织中TRAF2蛋白表达量、p-IRE1α/IRE1α和p-p65/p65比值较L-GAD组降低更为明显(P<0.05)。见图3,表5。

3 讨论

现代药理学研究发现,天麻素具有抗炎、抗氧化、抗血小板、降低血压和增强免疫功能的作用,对中枢系统、心血管系统和免疫系统等均具有较强的药理活性[9]。Li等[10]研究表明,天麻素通过激活PI3K-Akt通路中mTOR信号抑制细胞自噬,从而保护新生大鼠心肌细胞免受缺氧/复氧损伤。Fu等[11]报道,天麻素预处理通过促进自噬流量减轻心肌缺血再灌注损伤。Xing等[12]报道,天麻素通过上调 microRNA-21保护大鼠心肌细胞 H9c2免受缺氧损伤。本研究建立AMI大鼠模型,造模后,HE染色法观察显示AMI大鼠心肌细胞排列紊乱,发生大量变性、坏死,心肌纤维肿胀、断裂,存在大量炎性细胞浸润;TTC法检测显示AMI大鼠存在明显的心肌梗死;同时,大鼠心功能参数发生异常。经过天麻素干预后,大鼠心肌组织病理损伤减轻,心肌梗死面积减小,心功能参数显著改善,提示天麻素能够减轻AMI引起的心肌损伤。

图3 天麻素对大鼠心肌组织IRE1α/TRAF2/NF-κB通路蛋白表达的影响

表5 天麻素对大鼠心肌组织IRE1α/TRAF2/NF-κB通路蛋白表达的影响 n=10,pg/ml,

炎性反应是机体常见的病理过程,可发生于机体各组织和器官,AMI后,梗死区缺血缺氧,心肌能力供给不足,心肌细胞代谢、氧化应激及钙离子通道等多方面改变使得细胞发生坏死与凋亡,进一步引起强烈的炎性反应,加重心肌损伤。抑制AMI后过度炎性反应可能对心功能改善起积极的影响[13]。TNF-α和IL-6作为炎症及调节机体免疫的重要细胞因子,临床检查显示TNF-α和IL-6在心血管疾病患者的心肌组织中高表达,且表达水平与疾病的严重程度密切相关[14]。MCP-1在心肌缺血中属于较为活跃的趋化因子,可诱导单核细胞向内皮细胞趋化并黏附,参与心肌缺血诱导的炎性反应,促进单核细胞转化为巨噬细胞[15]。TNF-α、IL-6、MCP-1共同参与梗死心肌炎性反应的全过程,调节TNF-α、IL-6、MCP-1的释放对减轻心肌缺血性损伤至关重要。Han等[16]报道,天麻素通过调节凋亡相关信号蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和炎性细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β的表达,对心肌缺血再灌注损伤起到保护作用。本研究中,AMI大鼠血清及心肌组织中TNF-α、IL-6、MCP-1炎性因子表达均升高。天麻素干预后,AMI大鼠血清及心肌组织中TNF-α、IL-6、MCP-1炎性因子水平均显著降低,提示天麻素对AMI诱导的炎性反应有一定抑制作用。

TRAF2是肿瘤坏死因子受体相关因子家族中的一员,可与肿瘤坏死因子受体家族的多个受体结合,介导相关因子的生理活化,被认为是调节NF-κB表达的关键上游因子。IRE1α则是内质网应激过程中参与未折叠蛋白激活的保守信号通路的重要组成部分。IRE1α通过与TRAF2结合被磷酸化激活,导致NF-κB通路的激活,而NF-κB的激活是抗原呈递细胞产生炎性因子的重要步骤,NF-κB包含p65、p50等多个亚单位,在正常生理状态下,以无活性的同源二聚体形式存在,当多种病理因素刺激时,NF-κB被磷酸化被激活,转移至细胞核内与特定靶基因结合发挥调控基因转录作用,释放炎性因子等,导致组织过度炎性反应及损伤。多项研究报道,IRE1α/TRAF2/NF-κB通路通过调节炎性反应参与多种疾病的发生发展[17]。Yuan等[18]研究发现,天麻素可通过介导IRE1α/TRAF2/NF-κB通路抑制大鼠肝移植急性排斥反应。

本研究结果显示,AMI大鼠心肌组织中TRAF2蛋白表达量、p-IRE1α/IRE1α和p-p65/p65比值均明显升高,而经过天麻素干预后,AMI大鼠心肌组织中TRAF2蛋白表达量、p-IRE1α/IRE1α和p-p65/p65比值均明显降低。该结果提示天麻素可能通过调控IRE1α/TRAF2/NF-κB通路抑制AMI诱导的炎性反应,减轻AMI大鼠心肌损伤和心肌梗死面积。