β-榄香烯通过调控RBBP4/H3K27通路抑制结肠癌肝转移

章波 林恒军 邱学科 张继超 王丽红

[摘要] 目的 探究β-欖香烯（β-elemene，β-E）抑制结肠癌进展的潜在机制。方法 使用移植肿瘤模型验证β-E在体内抑制结肠癌的生长作用。将不同浓度（0～400μmol/L）的β-E作用于结肠癌细胞，利用CCK-8、细胞克隆、Transwell实验和蛋白质印迹法等评估细胞活力、迁移和侵袭能力。结果 5-Fu组和β-E组小鼠的结肠肿瘤重量均显著低于模型组（P<0.05），5-Fu组小鼠的结肠肿瘤抑制率显著高于β-E组[（59.22±0.11）% vs. （36.63±0.09）%，P<0.05]。5-Fu组和β-E组小鼠的肝转移灶数量显著少于模型组（P<0.05）。β-E可抑制结肠癌细胞增殖、克隆和侵袭。β-E显著抑制结肠癌组织中RBBP4和H3K27me3表达（P<0.05）。结论 β-E可抑制结肠癌细胞增殖和侵袭，可能与其调控RBBP4功能重塑H3K27甲基化有关。

[关键词] 结肠癌；β-榄香烯；RBBP4；H3K27me3

[中图分类号] R445.1      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.16.020

β-Elemene inhibits liver metastasis of colon cancer by regulating RBBP4/H3K27 pathway

ZHANG Bo1， LIN Hengjun1， QIU Xueke1， ZHANG Jichao1， WANG Lihong2

1.Department of Colorectal and Anal Surgery， Jinhua Peoples Hospital， Jinhua 321000， Zhejiang， China; 2.Department of Pharmacy， Affiliated Hospital of Shaoxing University （Shaoxing Municipal Hospital）， Shaoxing 312000， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To explore the new potential mechanism of β-elemene （β-E） inhibiting the colon cancer. Methods The effect of β-E in inhibiting the growth of colon cancer in vivo was verified using a transplanted tumor model. Different concentrations （0-400 μmol/L） of β-E were used to act on colon cancer cells， and then the cell viability， migration and invasion were evaluated by CCK-8， cell cloning， Transwell assay and Western blotting. Results The weight of colon tumor in 5-Fu group and β-E group were significantly lower than those in model group （P<0.05）. The inhibition rate of colon tumor in 5-Fu group was significantly higher than that in β-E group [（59.22±0.11）% vs. （36.63±0.09）%， P<0.05]. The number of liver metastases in 5-Fu group and β-E group was significantly lower than that in model group （P<0.05）. β-E could inhibit the proliferation， cloning and invasion of colon cancer cells. β-E significantly inhibited the expression of RBBP4 and H3K27me3 in colon cancer tissues （P<0.05）. Conclusion β-E can inhibit the proliferation and invasion of colon cancer cells， which may be related to the regulation of RBBP4 function remodeling H3K27 methylation.

[Key words] Colon cancer; β-Elemene; RBBP4; H3K27me3

结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，发病率和病死率均较高[1]。虽然手术、放射治疗及多模式联合化疗已成为治疗该病的标准程序，但患者的生存情况近年来并没有明显改善[2-3]。视网膜母细胞瘤结合蛋白4（retinoblastoma binding protein 4，RBBP4）是多个染色质修饰复合物的主要成分，在组蛋白的翻译后修饰中起多种作用，包括乙酰化、去乙酰化和甲基化。RBBP4表达上调与肺癌、甲状腺、肝细胞癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤密切相关[4-6]。RBBP4可通过调控组蛋白3第27位赖氨酸三甲基化（histone H3 lysine 27 trimethylation，H3K27me3）活性，导致肿瘤抑癌基因的转录抑制[7]。因此，RBBP4被认为是一种结肠癌治疗靶点，寻找靶向RBBP4的药物引起广泛关注。研究表明，天然药物产物在抗癌治疗中发挥关键作用。姜黄属的根茎作为传统中草药是一种常用的活血化瘀药物，从中提取的β-榄香烯（β-elemene，β-E）已被证明是一种新型的抗肿瘤候选药物[8]。多项研究发现，β-E对肝癌、胃癌、乳腺癌和脑癌等具有抗肿瘤作用，其制剂已被批准为化疗辅助药物[9-12]。然而，目前的研究多为探索β-E如何在体内影响结肠癌，但其具体作用机制仍不明确。本研究发现，β-E可通过调节RBBP4/H3K27me3信号通路诱导结肠癌细胞凋亡，抑制结肠癌转移，现报道如下。

1  资料与方法

1.1  主要试剂

β-E（纯度>95%）购自大连金刚药业有限公司。

1.2  实验动物模型构建

6～8周龄雄性BALB/c小鼠（n=30）购自青龙山动物繁殖场[实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2022-0001]。所有小鼠均在无特定病原体条件下喂养。通过建立原位移植结肠癌模型来评估肝转移。具体操作：注射CT26.WT细胞（1×106细胞/ml）进入小鼠腋窝（n=6），待肿瘤增长至约1cm3，处死小鼠，取下肿瘤并切成1mm3碎片。取18只小鼠造模，切开左下腹，使用Histoacryl黏合剂把肿瘤碎片附着于小鼠结肠区域，缝合小鼠腹腔。另取6只小鼠切开左下腹，不进行任何操作直接缝合腹腔，纳入对照组。造模3d后，18只造模小鼠随机分为模型组、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）组和β-E组，每组各6只。5-Fu组小鼠给予5-Fu腹腔注射，30mg/（kg·3d）；β-E组小鼠给予β-E灌胃，6g/（kg·d）；对照组和模型组小鼠给予等量生理盐水灌胃。四组小鼠均干预15d，每3d记录一次小鼠体质量。末次给药后1h使用2%异氟烷麻醉小鼠，眼眦取血。处死小鼠，统计>1mm的转移性肝肿瘤的数量，称重并记录。根据下列公式计算肿瘤抑制率和肝轉移率：肿瘤抑制率=（1–处理组平均结肠肿瘤重量）/模型组平均结肠肿瘤重量×100%；肝转移率=处理组平均肝转移数/模型组平均肝转移数×100%。

1.3  细胞培养

人结肠癌细胞系HT-29购自上海生物化学与细胞生物学研究所，HT-29细胞在37℃、5% CO2的DMEM培养基中培养。RBBP4质粒由GenePharma（中国上海）合成。通过蛋白质印迹法验证构建RBBP4细胞转染是否成功。转染前，在6孔板中，每孔加入2ml含有1.0×106细胞的完全培养基。待细胞汇合度达70%左右，使用1.8ml不含胎牛血清的基础培养基代替，加入转染混合液200μl。2μg模拟物或质粒（购自GenePharma）分别用100μl Opti-MEM稀释。此外，2μl lipo3000（购自Thermo Scientific）也用100μl Opti-MEM稀释。然后将稀释的模拟物或质粒和稀释的lipo 3000按1∶1充分混合，混合液孵育10min，6孔板中每孔加入200μl混合溶液，细胞进一步培养48h用于后续分析。

1.4  细胞活力检测

采用CCK-8法评估细胞活力。将3×103个细胞接种于96孔板，加入不同浓度的β-E（0、25、50、100、200、400μmol/L，用于细胞毒性检测）分别于0、12、24、48h去除上清液，在相应时间点，向每个孔中加入100μl培养基和10μl CCK-8，37℃避光孵育2h，450nm处检测吸光度。在6孔板的盖玻片上培养细胞，使其生长至90%后处理细胞；用10mmol/L EdU溶液在无血清培养基中制备2×EdU溶液；预热2×EdU溶液，然后将其添加到等体积含有实验细胞的培养基中，获得1×EdU溶液。孵育后除去培养基，并向每个含有盖玻片的孔加入2.5ml含多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），室温下孵育15min；除去固定液，用2.5ml PBS洗涤孔中细胞5min，重复3遍；除去洗涤液，向前5个孔中加入2.5ml通透液，室温下孵育20min；除去通透液，用2.5ml PBS洗涤每个孔的细胞2次，除去洗涤液；每孔使用100?l反应混合物。反应混合物体积可根据实际情况进行调节，但必须按比例加入反应组分。向每个玻片加入100?l Click-iT反应混合物，室温下避光孵育30min；除去反应混合物，2.5ml PBS洗涤，除去洗涤液；之后进行核染色。按照试剂盒操作说明检测细胞增殖。

1.5  细胞迁移和侵袭检测

Transwell实验用于评估细胞迁移能力。将含1×105个细胞无血清培养基加入Transwell上室，再将含15%胎牛血清的700μl培养基添加至下室。37℃孵育24h后，用棉签去除非侵入细胞。迁移至下层的细胞多聚甲醛固定并用1%结晶紫染色。随机选取5个视野在显微镜下拍照并计数阳性细胞。

1.6  细胞集落形成实验

在6孔板中每孔接种1.5×103个细胞，每3d换液，培养2周。2周后，4%多聚甲醛固定15min，再用0.1%结晶紫染色30min。最后，使用显微镜统计细胞群落数。

1.7  蛋白质印迹法

收集细胞总蛋白，采用BCA试剂盒测定浓度。使用SDS-PAGE凝胶对30?g总蛋白和4?l标记物进行电泳，随后转移至0.22μm PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭，膜与相关一抗[抗人GSDMD（1∶1000）、抗RBBP4（1∶1000）、抗兔胱天蛋白酶3（caspase-3，1∶1000）、抗兔多腺苷二磷酸核糖聚合酶（1∶1000）、抗鼠GSDMD（1∶1000）、抗GAPDH（1∶5000）、抗兔p-eIF2α（1∶1000）、抗兔eIF2α（1∶1000）、抗兔ATF4（1∶1000）]在4℃孵育12h。PBST清洗3次，与兔二抗（1∶10000）或鼠二抗（1∶10000）孵育2h后，PBST清洗3次后，进一步用ECL发光液显影。使用IPP6.0软件进行图像分析。

1.8  统计学方法

使用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计量资料使用均数±标准差（）表示，两组比较采用t检验，多组比较采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  β-E抑制小鼠结肠癌原位移植瘤生长

本实验造模成功率100%。模型小鼠腹部進行性肿胀，伴有腹泻，活动减少，水和食物摄入减少。β-E组小鼠背部毛发光泽光滑，行为正常，水和食物摄入量增加，而5-Fu组小鼠精神状态较差，行动迟缓。对照组和模型组小鼠体质量比较差异无统计学意义，5-Fu组小鼠体质量显著低于对照组，β-E组小鼠体质量显著高于5-Fu组。5-Fu组和β-E组小鼠的结肠肿瘤重量均显著低于模型组（P<0.05），见图1。5-Fu组小鼠的结肠肿瘤抑制率显著高于β-E组[（59.22±0.11）% vs.（36.63±0.09）%，P<0.05]。

2.2  β-E减少小鼠模型的肝转移

模型组、5-Fu组和β-E组小鼠尸检，肝脏可见单个或多个白色结节，即肝转移灶，见图2A。5-Fu组和β-E组小鼠的肝转移灶数量显著少于模型组（P<0.01），见图2B。

2.3  β-E抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭

细胞增殖实验结果表明，不同浓度的β-E刺激HT-29细胞24h后，细胞活力呈浓度依赖性降低；100μmol/L的β-E刺激HT-29细胞，HT-29细胞活力呈时间依赖性降低；不同浓度的β-E（0～200μmol/L）刺激HT-29细胞24h后，细胞侵袭和克隆能力均呈浓度依赖性降低，见图3。

A.不同浓度β-E刺激HT-29细胞24h的细胞活力；B.100μmol/L的β-E刺激HT-29细胞不同时间的细胞活力；C.不同浓度β-E刺激HT-29细胞24h后的迁移细胞数；D.不同浓度β-E刺激HT-29细胞24h后的细胞克隆数

2.4  β-E对结肠癌组织RBBP4和H3K27me3表达的影响

模型组结肠癌组织中RBBP4和H3K27me3表达显著高于对照组（P<0.05），与模型组比较，β-E显著抑制结肠癌组织中RBBP4和H3K27me3表达（P<0.05），见图4。

3  讨论

β-E作为姜黄的主要成分之一，是一种新型抗肿瘤药物，已被开发成注射剂、乳剂和其他剂型治疗癌症，如脑癌、肺癌和肝癌等。研究发现，β-E能阻断胶质母细胞瘤、膀胱癌的细胞周期，并影响凋亡相关基因如caspase-3的表达，调节乳腺癌细胞上皮间质转化[13]。本研究旨在探讨β-E对结肠癌的影响及其可能的分子机制。在结肠癌原位模型中，β-E显著降低小鼠结肠肿瘤重量及肝转移率。同时，体外实验结果也表明，β-E可有效降低结肠癌细胞的生长、迁移和侵袭能力，说明β-E具有抑制肿瘤发展和转移的潜力。

RBBP4蛋白参与染色质组装、重塑和核小体修饰等各种生物过程[6]。既往研究表明RBBP4在结肠癌组织中升高与其预后不良和肝转移密切相关[14]。本研究发现，RBBP4在结肠癌组织中表达水平明显升高，表明其在结肠癌中可能发挥致癌作用，而β-E治疗后RBBP4表达显著降低。H3K27me3与原癌基因c-Myc、肿瘤抑制基因p53和基质金属蛋白酶2/9及上皮间质转化的标志物高度相关[15-17]。本研究中，β-E显著抑制结肠癌组织和细胞中H3K27me3的表达，提示β-E抑制结肠癌细胞增殖可能与抑制H3K27me3表达有关。多梳抑制复合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）是H3K27二甲基化和三甲基化的主要阅读蛋白。RBBP4具有组蛋白甲基转移酶修饰活性，与PRC2甲基转移酶异常组蛋白甲基化有关。本研究结果表明RBBP4介导的PRC2甲基转移酶活性对β-E抑制H3K27me3活化很重要。

綜上，β-E可通过调控RBBP4/H3K27通路抑制结肠癌的增殖和侵袭过程，可能是一种潜在的治疗结肠癌的候选药物。

[参考文献][1] LIU X， LIU Q， WU X， et al. Efficacy of various adjuvant chemotherapy methods in preventing liver metastasis from potentially curative colorectal cancer： A systematic review network Meta-analysis of randomized clinical trials[J]. Cancer Med， 2023， 12（3）： 2238–2247.

[7] MU W， MURCIA N S， SMITH K N， et al. RBBP4 dysfunction reshapes the genomic landscape of H3K27 methylation and acetylation and disrupts gene expression[J]. G3 （Bethesda）， 2022， 12（6）： jkac082.