EGCG 改善高果糖饮食小鼠代谢紊乱的作用与机制研究

周继红，陈蔚，丁乐佳，王岳飞

浙江大学茶叶研究所，浙江 杭州 310058

随着我国经济飞速发展与人民消费水平不断提高，国民对甜食及含糖饮料的喜爱度与日俱增[1]。高果糖玉米糖浆（High fructose corn syrup，HFCS）是甜食及软饮料中甜味剂的主要来源之一[2]。饮食是健康的重要决定因素，已有流行病学研究发现过量摄入果糖的饮食习惯同肥胖症、脂肪肝等代谢综合征的发生具有相关性[3-6]。因此，通过安全有效的膳食调节方式防治高果糖饮食诱导的相关代谢综合征成为了食品营养科学和健康领域亟待解决的重要问题。

茶作为一种具有促进健康作用的功能性食品和饮料，被人们广泛饮用。表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）作为绿茶中含量最高的多酚类物质组成成分之一，已被证明在缓解代谢障碍[7-8]及抗炎方面[9-10]效果显著。然而，现有的EGCG调节食源性肥胖、代谢障碍及炎症等方面的机制研究主要聚焦于高脂膳食模型或高葡萄糖、高蔗糖膳食模型，对高果糖饮食诱发的代谢障碍及炎症反应的调节机制仍有待明晰。本研究基于高果糖饮食诱导的C57BL/6J 小鼠模型，从EGCG 对小鼠脂质积累、血糖调节能力、肝功能、脂质代谢以及炎症反应的作用与机制展开研究，为挖掘膳食补充EGCG 改善高果糖饮食诱导的代谢紊乱的膳食干预新靶点奠定理论基础和试验基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

15 只4 周龄雄性SPF 级C57BL/6 小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司[SCXK（浙）2018-0006]，饲养于浙江大学动物实验中心SPF 级动物房。小鼠均在标准环境内（温度22～26 ℃，相对湿度40%～70%，12 h/12 h 光暗循环）合笼饲养（每笼5 只）。试验期间小鼠自由摄食及饮水。

1.1.2 药品与试剂

EGCG（纯度≥98%）购自湖州荣凯植物提取有限公司；普通小鼠饲料、高果糖小鼠饲料（17%果糖供能，其他比例参照美国Research Diets 公司D12451 饲料配方）、高果糖添加1% EGCG 小鼠饲料（前者基础上添加1% EGCG）购自上海帆泊生物技术有限公司；苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒、油红O 染色试剂盒、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor，TNF-α）/白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）/白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；Trizol 试剂盒购自赛默飞世尔中国。

1.1.3 仪器与设备

SW-CJ-1FD 超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；KZ-Ⅲ-FP 高速组织研磨仪、MX-F 涡旋混合器，武汉赛维尔生物科技有限公司；D3024R 台式高速冷冻型微量离心机，大龙兴创实验仪器（北京）股份公司；One-Touch UltraVue 血糖仪及试纸，强生（中国）医疗器械有限公司；TBA-40FR 全自动生化分析仪，日本东芝；FBZ2001-up-p 标准试剂型纯水仪，青岛富勒姆科技有限公司；Epoch酶标检测仪，美国伯腾仪器有限公司；CFX荧光定量聚合酶链式反应（ Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction ，qRT-PCR）仪，美国Bio-Rad 公司；NanoDrop 2000 超微量分光光度计，赛默飞世尔中国。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组及干预方案

15 只4 周龄雄性C57BL/6 小鼠适应性喂养14 d 后根据体质量(20±2)g 随机分为正常饮食组（Normal chow diet，NCD）、高果糖饮食组（High-fructose diet，HFD）、高果糖补充1% EGCG 组（High-fructose+EGCG diet，HFE），其中EGCG 浓度在已有文献[11-14]及前期预试验的基础上确定。持续饲喂8 周，每周记录两次小鼠摄食量（摄食量=给食量－剩食量）、体质量并计算能量利用率（能量利用率=增重量/摄入能量×100%）。本研究经浙江大学实验动物伦理委员会审查批准（审批号：ZJU20210199）。

1.2.2 口服葡萄糖耐量检测

第 8 周测定小鼠口服葡萄糖耐量（Oral glucose tolerance test，OGTT）值：对小鼠禁食16 h 后测定小鼠空腹血糖值，再以30%葡萄糖溶液按2 g·kg-1剂量对小鼠进行灌胃，使用快速血糖仪分别于15、30、60、90、120 min在小鼠尾部取血测定血糖值。通过计算血糖曲线下面积（Area under the curve of blood glucose，AUC）得出血糖贡献比例：

式中，AUCB为NCD 曲线下面积；AUCP为HFD、HFE 曲线下面积。

1.2.3 血液生化指标检测

第8 周末处死小鼠，取眼内眦静脉窦血约3 mL 置于离心管中，静置2 h 后以3 000 r·min-1离心20 min，取血清放置-80 ℃冰箱备用。后续利用全自动化分析仪检测小鼠谷丙转氨酶（Alanine Transaminase，ALT）和谷草转氨酶（Aspartate Transaminase，AST）指标。

1.2.4 组织形态学观察

将小鼠结肠同一位置部分组织置于4%多聚甲醛固定液中固定24 h，石蜡包埋、切片后，依照苏木精-伊红染色（Hematoxylin-eosin Staining，HE）试剂盒说明书进行染色，中性树脂封片后在显微镜下观察各组小鼠肠道组织学形态，判断其组织完整性及受损情况。

将小鼠肝脏同一位置部分组织用蔗糖溶液脱水，冰冻切片包埋后依照油红O 染色试剂盒说明书进行操作，在显微镜下观察小鼠肝组织中脂滴积累情况。

1.2.5 ELISA 检测炎症因子释放水平

取小鼠肝脏按质量体积比1∶9 加入0.9%生理盐水，并在冰水浴条件下制备成10%的匀浆，3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，依照ELISA 试剂盒说明书测定TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量。以同样的方式制备肠道组织匀浆，离心后取上清液，按说明书测定IL-6 的含量。

1.2.6 实时荧光定量 PCR 检测关键基因表达水平

将肝脏、结肠组织研磨后，依照 Trizol试剂盒对其进行总RNA 抽提，使用NanoDrop 2000 超微量分光光度计测定RNA 浓度。根据浓度结果稀释样品并将其反转录为cDNA。调节cDNA 浓度后结合SYBR 反应体系，对肝脏中固醇调节元件蛋白 1c（ Sterol regulatory-element-binding protein-1c ，SREBP-1c）、结肠中胞质闭锁小带蛋白-1（Zonula occludens-1，ZO-1）和跨膜紧密连接蛋白Occludin，肝脏和结肠中Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/髓样分化因子（Myeloid differentiation factor 88，MyD88）的基因表达水平进行测定，PCR 引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR 引物序列Table 1 Primer sequences of qRT-PCR

1.2.7 免疫组化检测ZO-1、Occludin 蛋白分布及表达

将包埋的蜡块切片进行常规脱蜡和水化，使用0.01 mol·L-1枸橼酸缓冲液（pH 6.0）抗原修复，3%双氧水进行处理，然后画圈并进行血清封闭后，通过一抗（抗ZO-1、Occludin抗体）封闭保持4 ℃过夜孵育，第二天二抗室温孵育，待显色后再用苏木精复染，最后将切片脱水、透明、封片。

1.2.8 数据处理及分析

采用 Image J 软件处理图像，GraphPad Prism 8 软件处理试验所获数据并对其进行分析统计及图表绘制。试验数据采用平均数±标准差（±SD）表示，两组间数据比较采用t检验，多组间数据比较采用One-way ANOVA单向方差分析和Tukey 事后检验，以P＜0.05表示差异达到统计学显著水平。

2 结果与分析

2.1 EGCG 对高果糖饮食小鼠体重、组织表征及血糖调节能力的改善作用

各组小鼠初始体重无显著差异，相应饲料饲喂8 周后，HFD 组小鼠体重显著高于NCD组（P＜0.05），HFE 组小鼠体重增幅回降明显，平均体重与NCD 组无显著差异（图1A）。在日平均进食量、摄入能量方面，各组小鼠均无明显差异（图1B 和图1C）。在能量利用率方面，HFE 组显著低于HFD 组（P＜0.05），与NCD 组无显著差异（图1D）。小鼠脂肪组织质量及组织形态学染色结果表明（图1E 和图1F），HFD 组小鼠脂肪质量和体积显著大于NCD 组和HFE 组（P＜0.05）；HFE 组小鼠附睾脂肪组织细胞大小显著低于HFD 组（P＜0.05），与NCD 组无明显差异。以上结果说明，膳食补充EGCG 能够在不影响小鼠的摄食量及日常行为活动的基础上，减轻脂质的过量积累及脂肪质量，缓解高果糖饮食诱导的小鼠体重增长。

图1 EGCG 对小鼠体重、组织表征及血糖调节能力的影响Fig. 1 The effects of EGCG on body weight, tissue characterization and blood glucose regulation ability in mice

OGTT 可反映小鼠的血糖调节能力。图1G显示，HFD 组小鼠血糖浓度在灌胃葡萄糖溶液15 min 后达到峰值，为(21.54±2.02) mmol·L-1，且无法在2 h 内回降到正常的糖耐量水平（＜8.1 mmol·L-1）；HFE 组小鼠的血糖浓度峰值为(15.22±2.09) mmol·L-1，显著低于HFD 组（P＜0.05），并可在2 h 内回稳至正常血糖浓度。进一步通过AUC 比较各组小鼠基础血糖和给药后对血糖浓度的贡献比例，结果表明，HFE组给药血糖贡献度较HFD 组下降了约7%，提示EGCG 能够延缓高果糖饮食诱导的小鼠升糖水平，并缩短回稳至正常血糖水平的时间。

2.2 EGCG 对高果糖饮食小鼠肝脏表征及炎症反应的改善作用

肝脏能够通过糖原合成、分解、储存和释放等调节血糖水平，因此进一步对肝脏进行形态学染色观察及相关参数测定。在肝脏重量方面，HFE 组小鼠肝脏重量较HFD 组显著降低（P＜0.05），且与NCD 组无明显差异（图2A）。染色结果表明（图2B），油红O 可特异性吸附脂肪从而使其呈红色，HFD 组细胞中存在大量脂滴，HFE 组脂滴面积显著下降；HE 染色可使细胞核呈蓝紫色，细胞质和细胞外基质呈红色，未着色部分表示空泡，空泡越多面积越大代表肝脂肪变程度越高，图2B 中可见HFD 组胞浆内界限不明，出现大量空泡，存在明显的肝脂肪变，而HFE 组中上述情况有明显改善。ALT、AST 水平是评估肝脏功能的基础指标，图2A 显示，各组之间的ALT、AST 水平没有显著差异。在炎症因子方面（图2C），各组IL-6 含量无显著差异，HFD 组炎症因子TNF-α、IL-1β释放水平显著高于NCD组（P＜0.05），HFE 组略有降低但同HFD 组相比差异并不显著。以上结果表明，EGCG 可能通过抑制肝脏内脂质积累、降低炎症TNF-α、IL-1β因子水平来维稳高果糖饮食背景下的肝脏功能。

图2 EGCG 对小鼠肝脏表征、肝功能及炎症因子释放水平的影响Fig. 2 The effects of EGCG on liver characterization, liver function and release levels of inflammatory factors in mice

2.3 EGCG 对高果糖饮食小鼠肠道表征及炎症反应的改善作用

除肝脏外，肠道作为食物消化、营养吸收的主要器官，在稳定血糖血脂水平、调节脂质代谢等方面也具有重要作用。肠壁完整性是维持肠道功能的基础，小鼠结肠组织HE 染色结果表明（图3A），HFD 组小鼠肠壁显著变薄、黏膜下层水肿、腺腔消失、腺体多数不完整、排列紊乱，说明HFD 组小鼠肠道发生了结构损伤；HFD 组小鼠黏膜淋巴细胞增生明显，上皮细胞和杯状细胞存在大面积丢失情况，表明HFD 组小鼠可能存在潜在的炎症。与HFD组相比，HFE 组小鼠腺体结构较为完整，腺腔排列状况明显改善，仅存在少数杯状细胞丢失现象。进一步从各组炎症因子释放水平判断（图3B），HFE 组小鼠的IL-6 含量低于HFD组，但差异并不显著。上述结果表明，EGCG能够缓解高果糖饮食诱导的肠道结构损伤，抑制炎性情况。

图3 小鼠结肠HE 染色结果（20.0×、40.0×）及肠道炎症因子IL-6 浓度Fig. 3 HE scanning of colon（20.0×、40.0×）and IL-6 concentration

2.4 EGCG 对高果糖饮食小鼠脂质代谢及炎症反应相关通路关键基因表达的影响

在上述研究结果的基础上，为进一步探究高果糖饮食下EGCG 通过肝-肠轴来抑制代谢紊乱的分子机制，检测了肝脏中调控脂质代谢Srebp-1c和炎性反应Tlr4、Myd88基因的表达，以及肠道组织中调控肠壁完整性Zo-1、Occludin和炎性反应Tlr4、Myd88基因的表达。图4A 显示，与NCD 组相比，HFD 组小鼠肝脏中Srebp-1c、Tlr4和Myd88基因表达水平显著上升（P＜0.05），但与HFE 组相比没有显著差异。如图4B 所示，在肠壁完整性方面，HFE 组小鼠肠道中Zo-1基因表达水平显著高于HFD 组（P＜0.05），Occludin基因表达水平在各组之间无显著差异；在炎性反应方面，HFE 组小鼠的Tlr4、Myd88基因表达水平显著低于HFD 组（P＜0.05），且同NCD 组无明显差异。为明确EGCG 对高果糖饮食诱导小鼠ZO-1、Occludin 的蛋白分布及表达水平的影响，进一步通过免疫组化检测了ZO-1、Occludin 蛋白在肠组织的分布及平均光密度。图4C 和4D 显示，ZO-1 蛋白主要位于细胞膜内，Occludin 蛋白主要分布于细胞膜外，两者均沿膜连续分布。HFD 组ZO-1 和Occludin蛋白均呈弱阳性表达，棕黄色颗粒明显减少且染色淡，通过平均光密度值计算蛋白表达水平，统计显示HFE 组ZO-1 和Occludin 蛋白表达水平明显高于HFD 组（P＜0.05），且同NCD 组无明显差异。这表明膳食补充EGCG可能通过抑制肝脏Srebp-1c基因表达来调节高果糖饮食引起的脂质代谢紊乱，提高Zo-1基因表达水平，以及ZO-1 和Occludin 蛋白表达水平来保障肠道结构和功能，共同下调肝脏、肠道中Tlr4和Myd88基因表达水平来改善炎性情况。

图4 小鼠肝脏和肠道组织相关基因及蛋白表达水平Fig. 4 Expression levels of related genes in liver and intestinal tissues in mice

3 讨论

19 世纪70 年代起，HFCS 因其甜度高、易获取、成本低等特点，代替蔗糖逐渐成为食品加工业中糖果、蛋糕、软饮料等产品的主要甜味添加剂之一，导致摄入高果糖的人群比例逐年升高。越来越多的研究表明，长期摄入高果糖会导致内脏脂肪积累、糖脂代谢紊乱、氧化应激和慢性轻度炎症等，成为诱发肥胖症、心脑血管疾病、非酒精性脂肪肝病、胰岛素抵抗等代谢综合征的危险因素[15]。Gao 等[16]研究发现，过量摄入果糖会使大鼠体重增加；Hernandez-Diazcouder 等[17]发现，果糖可激活脂肪生成途径从而促进白色脂肪组织的积累。目前，针对高果糖饮食诱导的相关代谢障碍，主要采用药物方法进行干预，但往往存在缺乏有效靶向治疗途径、副作用强、建立耐受周期长[18]等缺点，因此从天然食物中找寻改善高果糖饮食诱导代谢紊乱的潜在功能因子，探究其主要调控机制具有重要的科学价值与社会价值。Seo 等[19]试验发现，长期饲喂富含多酚的酿酒葡萄籽粉能够显著缓解高脂高果糖饲喂小鼠体重增加、内脏肥胖和高脂血症的情况；Han 等[20]发现，山楂提取物有效改善了小鼠肝脏的炎症和血脂异常；Yamamoto 等[21]研究发现，黑豆多酚能够抑制小鼠肝脏的脂质积累及炎症反应。而EGCG 作为绿茶多酚类物质中含量最高、活性最强的儿茶素成分，在减少高果糖饮食引起的负面变化方面也具有良好潜力。程倩[22]发现，EGCG 能够抑制高果糖饮食诱导的小鼠体重增长；Mi 等[23]发现，EGCG 能抑制高脂高果糖饮食引起的脂肪细胞肥大和脂质积累。与上述结果相似，本研究结果表明，膳食补充EGCG 能够有效恢复高果糖饮食小鼠的血糖调节能力，显著抑制小鼠脂肪组织重量增加、细胞体积增大及脂质积累，并通过调节ALT 和AST 水平来改善肝脏受损情况。但是，目前EGCG 对高果糖膳食模型的预防作用往往关注EGCG 对单一器官或单一通路的影响，缺乏对多组织多器官的综合探讨与分析，本研究旨在探讨EGCG 在肠道、肝脏协同调控情况下对高果糖饮食的预防作用。

肠道和肝脏作为果糖代谢的关键器官，能够通过门静脉系统实现营养成分及代谢产物的相互联系，这一双向交流通路被称作肠-肝轴[24]。果糖被摄入后首先会在小肠上皮细胞中与5 型葡萄糖转运蛋白（Glucose transporter 5，GLUT5）结合，过量的果糖则会经由门静脉溢出至肝脏[25]。因为果糖代谢不受胰岛素调节，且催化其代谢的磷酸果糖激酶为非限速酶，所以果糖在肝脏中代谢速度远高于葡萄糖，更易促进甘油三酯的合成和肝脂肪变性[26]。研究表明，过量摄入果糖会破坏肠壁完整性导致内毒素移位，增加促炎性反应信号释放和黏附分子数量[27]，以上信号又可经门静脉血液循环作用于肝脏[28]，诱发肠道和肝脏的炎症反应和功能障碍[29]。与上述研究类似，在膳食多酚干预中，Tu 等[30]研究发现口服酚类物质经由肠道代谢、肝脏循环参与介导。Li 等[31]研究表明，蔷薇多糖对肝脏有保护作用，并通过肠-肝轴调节炎症因子水平；Hu 等[32]研究发现，柑橘皮粉对肝脏和肠道的脂肪积累、促炎细胞因子的释放有较强的抑制作用。由此表明，肠-肝轴介导的脂质代谢和炎性反应是膳食多酚调节高果糖饮食诱导代谢紊乱的重要靶点。

肠道屏障是肠道发挥功能的基础，ZO-1和Occludin 作为促使肠道上皮细胞紧密连接的主要蛋白，与肠道通透性关系密切。Wilkinson 等[33]发现，犬肾细胞被敲低或敲除Zo-1后，膜张力下降，肠壁通透性增强，内毒素等有害物质进入血液循环并引发炎症反应。TLR4/MyD88 信号通路是介导炎性反应的重要通路，TLR4 识别对应信号后，通过下游信号传递分子MyD88 进行胞内信号传导，以至激活核因子-κB（Nuclear factor-κB，NF-κB），促使细胞分泌相关TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β等促炎因子诱导炎症的发生[33-34]。Wu 等[35]发现，TLR4 通过下调ZO-1 等紧密连结蛋白，并上调TNF-α、IL-1β、IL-6 促炎因子诱导炎症性肠病。Mir 等[36]研究表明，Occludin 缺乏小鼠会使乙醇诱导的TLR4 水平上升，从而破坏结肠上皮的连接导致肠屏障功能障碍。EGCG 已被证明能够通过恢复ZO-1、Occludin等蛋白表达水平[37]、改变白介素、TNF、TLRs等炎症因子的释放水平[38-39]、影响中性粒细胞相关酶活及形成途径[40]等方式来缓解全身炎症。本试验聚焦于膳食EGCG 和肠-肝轴的协同调控作用，结果显示，膳食补充EGCG 可显著上调肠道Zo-1基因表达水平、ZO-1 和Occludin 蛋白表达水平，降低高果糖饮食诱导小鼠肝脏中TNF-α、IL-1β炎症因子和肠道中IL-6 炎症因子水平，并抑制肠-肝轴中Tlr4、Myd88基因表达来协同调控高果糖饮食诱导的代谢紊乱，后续将围绕肠道菌群、胆汁酸、代谢酶类与激素等方面进行探究。

综上所述，膳食补充EGCG 可有效改善高果糖诱导的小鼠体重增加、脂质积累、血糖紊乱以及肝功能障碍，并可上调Zo-1基因表达水平、ZO-1 和Occludin 蛋白表达水平，以加强肠屏障功能，下调肝脏、肠道中 IL-6、IL-1β、TNF-α促炎因子水平以改善炎症反应，其作用机制可能与抑制TLR4/MyD88 信号通路有关（图5）。本研究从膳食多酚EGCG 和肠-肝轴协同调控的角度揭示了膳食补充EGCG 改善高果糖饮食诱导代谢紊乱的作用与机制，为EGCG 防治高果糖相关代谢综合征及相关功能食品的开发提供了试验依据与研究基础。

图5 EGCG 通过肝-肠轴调节高果糖诱导代谢紊乱的作用机制图Fig. 5 The mechanism of EGCG in regulating high-fructose diet-induced metabolic disorders through the gut-liver axis