微RNA-23a 通过缝隙连接蛋白43 对颈椎后纵韧带细胞骨向分化的作用机制

宋希猛，张卫红，袁士龙

济宁市兖州区人民医院脊柱外科，济宁 272100

颈椎后纵韧带骨化症（OPLL）是一种发生于颈椎后纵韧带的异位骨化疾病，多见于亚洲人群［1］。目前手术是治疗OPLL的首选方式，但其风险高、难度大，面临着较高的并发症（如脊髓损伤）风险［2-3］。因此，研究OPLL 发生机制及新型治疗方式备受关注。微RNA（miRNA）是成骨细胞发育至关重要的细胞间信号传导介体，本研究组前期采用高通量基因芯片技术检测OPLL 患者和非OPLL 患者miRNA 的表达差异，对其中下调最明显的50 个miRNA 逐个采用miRanda 软件预测分析，其中miR-23a 在OPLL 中下调较为明显，且有研究［4］表明，抑制其表达可通过促进软骨形成和血管生成来促进骨愈合，提示其具有调控成骨分化的作用。缝隙连接蛋白43（Cx43）是Connexins蛋白家族成员，是哺乳动物机体中分布最广、数量最丰富的连接蛋白，在细胞物质交换、电信号传达过程中具有重要作用［5］，体外实验证明，其高表达于OPLL 患者后纵韧带组织，且通过介导多条信号通路影响成骨分化基因表达［6-7］。此外，有学者［8］认为，Cx43可能存在与miR-23a的结合位点，其作为miR-23a 的靶基因发挥作用。大多数细胞中均存在丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），其被激活后可促进相关成骨细胞特异性蛋白表达，从而巩固骨分化信号［9-10］。本研究通过构建过表达及低表达miR-23a 的颈椎后纵韧带细胞，分析其对Cx43 的调控作用及颈椎后纵韧带细胞骨向分化的影响，并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

标本来源于本院收治的50 例间断型颈椎OPLL患者（OPLL 组）、50 例颈椎外伤非OPLL 患者（对照A 组）和50 例颈椎病非OPLL 患者（对照B 组）。所有患者经颈椎X 线、CT 及MRI 检查确诊，体质量指数（BMI）为18.5 ～ 24.9 kg/m2，心、肝、肾等主要器官功能正常，无糖尿病、高血压或高脂血症等慢性基础性疾病。OPLL组中男30例、女20例，年龄为32 ～65（47.78±5.25）岁；对照A 组男28 例、女22 例，年龄为36 ～ 67（48.12±6.03）岁；对照B组男32例、女28例，年龄为35 ～ 66（48.52±6.14）岁。均采取颈椎前路减压（经椎间隙或椎体次全切除）植骨融合内固定术治疗，将术中切除的后纵韧带组织留作标本（OPLL组留取间断非完全骨化的后纵韧带组织）。本研究经医院伦理委员会审批备案，受试者均对研究内容知情且签署同意书。

1.2 试剂和仪器

含绿色荧光蛋白的过表达质粒（miR-23a agomir）、低表达质粒（miR-23a antagomir）、阴性对照质粒（agomir NC）购自武汉淼灵生物科技有限公司；实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测试剂盒、荧光素酶活性试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒购自美国Sigma 公司；lipofectamineTM2000 脂质体转染试剂盒购自美国英杰生命技术有限公司；Cx43 一抗、p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）一抗、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）一抗、细胞外信号调节激酶（ERK1/2）一抗、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）一抗购自美国Abcam 公司。Synergy-HD显微镜（Toshiba，日本）；Synergy H4 全功能酶标仪（Bio Tek 公司，美国）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养［11］

酶消化法分离颈椎后纵韧带细胞。分别取OPLL 组、对照A 组、对照B 组约1 cm×1 cm 后纵韧带组织，无菌条件下冲洗干净深层组织血液及软组织碎屑，去除脂肪，将剩余组织剪碎，转移至5 mL灭菌离心管中，加入胰酶1.5 mL及胶原酶3 mL，充分混匀，37℃消化2 h，至管中无明显块状组织，低速离心（离心速度3 000 r/min，离心半径10 cm）去除沉淀，高速离心（离心速度12 000 r/min，离心半径8 cm）弃上清，DMEM 培养液将沉淀重悬，标准条件下培养，细胞融合度约80%时传代培养。倒置光学显微镜观察细胞形态。

1.3.2 培养细胞的miR-23a、Cx43表达［12-13］

取对数期的培养细胞，PBS 溶液冲洗，Trizol 法提取总RNA，鉴定浓度、纯度后反转录获取cDNA，定量后按照试剂盒说明书要求设定反应条件：93℃预变性6 min，95℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸25 s，重复40 个循环。miR-23a 上游引物：5’-G ACGTGCTCGGTGCACGCGTCCAC-3’；miR-23a下游引物：5’-TGCACGACGCTGCCACGCGCATGT-3’。Cx43上游引物：5’-GTGCACGCCACGTGCACGCACGCT-3’；Cx43 下游引物：5’-GTGACGTGCGTGCACGCTGCA AGC-3’。GAPDH上游引物：5’-GTGCACGCATGCAG TGCACCACAC-3’；GAPDH 下游引物：5’-CGCTTA CGCACGTGCTTAATGCAC-3’。以2-△△CT为目的基因相对表达强度，重复3 次取均值。

采用Western blotting 检测Cx43 蛋白表达。预冷PBS 洗涤后细胞裂解液冰上裂解，提取、定量蛋白。取40 μg待测样本，与等体积上样缓冲液混合，恒压下凝胶电泳30 min，湿膜法转膜，封闭液封闭室温摇床孵育2 h，加入Cx43 一抗（1∶1 000）4℃孵育过夜，TBTS 漂洗3 次，15 min/次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶8 000）室温孵育1 h，TBTS 漂洗3 次，15 min/次。暗室中曝光显影，去除膜上发光液，Gene Gnome 凝胶成像系统拍照，Image J软件分析，蛋白表达量以Cx43 蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值表示。

1.3.3 细胞转染［14］

取OPLL 组培养对数期细胞，经胰蛋白酶消化，接种于24 孔板，待细胞再次贴壁至80%时，更换无双抗的完全培养基。根据lipofectamineTM2000 脂质体法转染说明书分别转染miR-23a agomir质粒（miR-23a 过表达组）、miR-23a antagomir 质粒（miR-23a 低表达组）、agomir NC 质粒（转染对照组），未经处理的后纵韧带细胞为空白组，每组设置5 个复孔。37℃培养6 h，更换为完全培养基继续培养48 h。倒置荧光显微镜观察转染效率（%）=表达绿色荧光蛋白的细胞/总细胞数量×100%。

1.3.4 双荧光素酶实验［15］

采用生物信息学软件TargetScan、miRwalk 初步预测，构建Cx43 野生质粒（Cx43-WT）；再使用基因位点图片技术构建Cx43 突变质粒（Cx43-MT）。取OPLL 组培养对数期细胞，接种于96 孔板，融合度至75%时开始转染，按照lipofectamineTM3000 说明书，将Cx43-WT、MT 质粒与内参海肾荧光素酶质粒pRLTK 进行共转染，分为Cx43-WT+miR 内参组、Cx43-WT+hsa-miR-23a 组、Cx43-MT+miR 内参组、Cx43-MT+hsa-miR-23a 组，孵育48 h，经荧光素酶活性试剂盒检测荧光素酶活性，相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。

1.3.5 碱性磷酸酶（ALP）染色［16］

取miR-23a 过表达组、miR-23a 低表达组、转染对照组和空白组细胞，每组设置5 个复孔，加入矿化诱导液诱导，显微镜下观察到黄褐色的矿化结节后继续培养21 d。PBS 冲洗，每孔加入50 μL 的Triton X-100，4℃孵育过夜。每孔加入100 μL ALP底物，37℃孵育1 h，每孔加入50 μL NaOH（0.2 mol/L）终止反应，采用酶标仪测定各组410 nm处光密度值。

1.3.6 Western blotting 检测

取miR-23a 过表达组、miR-23a 低表达组、转染对照组和空白组细胞，每组设置5个复孔，裂解、定量蛋白、电泳等步骤同1.3.2中Cx43蛋白表达检测。加入p38 MAPK 一抗（1∶500）、p-p38 MAPK 一抗（1∶500）、ERK1/2一抗（1∶1 000）、p-ERK1/2一抗（1∶1 000），辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶8 000），分析蛋白表达量。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0 软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，用LSD-t检验行两两比较；以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞形态

培养14 d 后，有细胞从后纵韧带组织块周围爬出，瘦小、细长，多为菱形（图1a）；培养至21 d，细胞爬出量逐渐增加，排列较为整齐，多为多角形与梭形；折光状态好（图1b）；培养25 d，随着细胞增加，逐渐铺满瓶底，细胞胞体增大，放射状生长（图1c）。OPLL 组、对照A 组、对照B 组细胞形态无明显区别。

图1 颈椎后纵韧带细胞（×100）Fig. 1 Cervical posterior longitudinal ligament cells（×100）

2.2 miR-23a、Cx43 mRNA 及Cx43 蛋白表达情况

与对照A、B 组比较，OPLL 组miR-23a 表达降低，Cx43 mRNA 及蛋白表达升高，差异均有统计学意义（P＜ 0.05，表1，图2）；对照A、B组间miR-23a、Cx43 mRNA及Cx43蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05，表1，图2）。

表1 miR-23a、Cx43 mRNA 及Cx43蛋白表达Tab. 1 Expressions of miR-23a，Cx43 mRNA and Cx43 protein n=50，±s

表1 miR-23a、Cx43 mRNA 及Cx43蛋白表达Tab. 1 Expressions of miR-23a，Cx43 mRNA and Cx43 protein n=50，±s

注：*与对照A、B 组比较，P ＜ 0.05。Note：* P ＜ 0.05，compared with control A，B group.

组别GroupmiR-23aCx43 mRNACx43 蛋白Cx43 protein OPLL0.30±0.04*1.41±0.15*1.26±0.13*对照A Control A 0.62±0.070.57±0.060.63±0.07对照B Control B 0.61±0.090.58±0.070.65±0.08

表 2 各组p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2表达Tab. 2 Expressions of p-p38 MAPK/p38 MAPK and p-ERK1/2/ERK1/2 in each group n=50，±s

表 2 各组p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2表达Tab. 2 Expressions of p-p38 MAPK/p38 MAPK and p-ERK1/2/ERK1/2 in each group n=50，±s

注：*与空白组比较，P ＜ 0.05；△与转染对照组比较，P ＜ 0.05。Note：* P ＜ 0.05，compared with blank group；△P ＜ 0.05，compared with transfection control group.

组别Groupp-p38 MAPK/p38 MAPK p-ERK1/2/ERK1/2空白Blank 0.41±0.040.38±0.05转染对照Transfection control 0.40±0.050.36±0.04 miR-23a 过表达miR-23a overexpression 0.16±0.02*△0.11±0.02*△miR-23a 低表达miR-23a low expression 0.91±0.09*△0.98±0.07*△

图2 Cx43蛋白表达Fig. 2 Expression of Cx43 protein

2.3 转染效率

荧光显微镜下可明显观察到绿色荧光细胞，转染效率为86%（图3）。

图3 miR-23a转染（×100）Fig. 3 miR-23a transfection（×100）

2.4 双荧光素酶实验

Cx43-WT+miR 内参组、Cx43-WT+hsa-miR-23a组、Cx43-MT+miR 内参组、Cx43-MT+hsa-miR-23a 组相对荧光素酶活性分别为1.06±0.09、0.91±0.08、1.01±0.10、1.03±0.11，Cx43-WT+hsa-miR-23a 组相对荧光素酶活性低于Cx43-WT+miR内参组，差异有统计学意义（P＜ 0.05，图4），提示miR-23a 可有效抑制野生型质粒荧光素酶活性。Cx43-MT+miR 内参组与Cx43-MT+hsa-miR-23a 组相对荧光素酶活性差异无统计学意义（P＞ 0.05，图4），提示miRNA 无法抑制突变型质粒荧光素酶活性。

图4 荧光素酶活性Fig. 4 Luciferase activity

图5 ALP 染色Fig.5 ALP staining

2.5 ALP染色

空白组、转染对照组、miR-23a 过表达组、miR-23a 低表达组矿化面积百分比分别为1.29±0.17、1.31±0.28、0.93±0.08、2.15±0.32，组间差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与空白组、转染对照组比较，miR-23a 过表达组矿化面积百分比降低，miR-23a 低表达组A 矿化面积百分比升高；空白组、转染对照组矿化面积百分比差异无统计学意义（P＞ 0.05，图5）。

2.6 p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2表达

与空白组、转染对照组比较，miR-23a 过表达组p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 表达降低，miR-23a 低表达组p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 表达升高，差异均有统计学意义（P＜ 0.05，表2，图6）；空白组、转染对照组比较，p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 表达差异均无统计学意义（P＞ 0.05，表2，图6）。

图6 各组p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2表达Fig. 6 Expressions of p-p38 MAPK/p38 MAPK and p-ERK1/2/ERK1/2 in each group

3 讨 论

目前OPLL 病因及发生机制尚停留在推测及学说阶段，主要包括椎间盘变性学说、机械应力损伤学说、骨质肥厚相关学说、糖代谢紊乱学说、遗传学说、钙代谢异常学说［17-18］。尽管研究已经较为深入，但因多种细胞生命活动均参与OPLL发生过程，其发生机理尚无法通过某单方面因素被充分解释［19］。因此，研究一些介导多个信号通路、显著影响疾病进程的关键性因素，对明确其发生机制、寻找新的靶向药物意义重大。

既往动物研究发现［20］，敲除小鼠Cx43 基因，其发育阶段膜内化骨与软骨内化骨被明显阻滞。亦有研究［21-22］证实，成骨细胞因缺乏Cx43 而矿化功能减弱，并对合成代谢信号的反应造成影响。本研究结果显示，与对照A、B 组比较，OPLL 组Cx43 表达升高。以上结论提示，在颈椎后纵韧带细胞骨化过程中，Cx43 可能发挥重要的调控作用，但关于其上游调节机制尚不清楚。miRNA 在控制骨骼分化中起着至关重要的作用，其中miR-23a 备受关注，其主要通过靶向（直接和间接）转录因子参与成骨细胞形成［23-24］。已有研究［25］表明，miR-23a 可通过介导Cx43 抑制雌激素缺乏引起的心脏间隙连接损伤，但在OPLL 中是否存在调控关系仍有待研究。本研究比较了对照A 组、对照B 组、OPLL 组后纵韧带组织中miR-23a 表达情况，并通过转染观察Cx43 表达变化及颈椎后纵韧带细胞骨向分化情况，结果显示，与对照A、B 组比较，OPLL 组miR-23a 表达降低，且过表达miR-23a 后Cx43 mRNA 表达降低，低表达miR-23a 后Cx43 mRNA 表达升高，且经双荧光素酶实验验证miR-23a 与Cx43 存在靶向关系；与空白组、转染对照组比较，miR-23a过表达组矿化面积百分比降低，miR-23a 低表达组矿化面积百分比升高，提示过表达miR-23a 可抑制颈椎后纵韧带细胞骨向分化，反之则具有促进作用，且可能通过靶向调控Cx43 参与OPLL发生。

MAPK 通路包括p38 MAPK、ERK 介导的级联反应，是调控细胞生长因子、促有丝分裂物质分泌的重要蛋白激酶，可在多种刺激因子作用下被激活［26-28］。Liu 等［29］采用细胞松弛素D 干预小鼠MC3T3-E1 成骨细胞时发现，其改善细胞成骨性的机制之一是促进p38 MAPK 信号通路。Yang 等［30］认为，葛根素可通过介导ERK1/2 和p38-MAPK 信号通路刺激成骨分化和骨形成。以上结果均提示MAPK 信号通路在骨向分化中的重要作用。此外，Chen 等［31］发现，在体内外骨化后纵韧带组织中ERK1/2，p38 MAPK 途径均被激活，且这些信号的激活取决于Cx43，降低Cx43 表达将导致机械作用减弱和信号传导减少。由此可见，受机械应力上调的Cx43 似乎部分通过激活ERK1/2 和p38 MAPK 信号来促进韧带成纤维细胞的成骨分化。本研究结果显示，与空白组、转染对照组比较，miR-23a 过表达组p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 表达均降低，miR-23a 低表达组p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 表达均升高，提示miR-23a可能通过调控Cx43 进而调控MAPK 通路影响颈椎后纵韧带细胞骨向分化。

综上所述，OPLL 病理条件下，颈椎后纵韧带细胞中miR-23a 异常低表达，通过靶向上调Cx43 激活MAPK 信号通路，促进成骨分化，参与OPLL 发生及发展。