川归胶囊质量标准及其治疗白癜风的作用机制研究

冯诗涵,崔亚玲,高 欢,刘 彤,许子华,赵庆春*

0 引言

白癜风是一种典型的色素脱失性疾病,全球的患病率为0.1%～8.0%,临床表现为皮肤出现白斑,对患者造成严重的心理打击,进而导致生活质量下降,患有精神疾病的可能性大大增加[1]。白癜风疾病的发病机制尚不明确,研究认为,其患病与自身免疫、氧化应激、黑色素细胞自毁、遗传等多方面功能障碍相关,上述因素导致黑色素细胞破坏,最终使患者皮肤色素脱失[2]。目前,临床上治疗白癜风的方法很多,包括口服药物治疗(中成药、左旋咪唑)、光疗(红外线、PUVA)、外科手术治疗、脱色、中西药联合治疗等。中医治疗白癜风与其他方法相比,临床应用经验丰富、疗效确切、复发率低、药材来源丰富、成本较低、毒副作用小,具有广阔的发展前景[3]。

川归胶囊由川芎、当归、补骨脂及白鲜皮组成。本方结合白癜风的发病机制,选以活血散瘀、清热凉血、疏肝理气、燥湿解毒、祛风通络之药来疏通经络,去除肌肤毛孔之闭塞,散其行于肌肤瘀滞,标本同治,临床治疗白癜风具有一定的疗效,但川归胶囊的药效物质基础及作用机制尚不明确。本研究主要通过网络药理学筛选其药效核心成分、靶点及通路,并对其治疗白癜风的作用机制进行探讨,将筛选出的核心成分阿魏酸进行定性定量研究,建立川归胶囊的质量标准,以保证临床用药安全、有效、质量可控。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(日本岛津SPD-20AT),硅胶G薄层板 (青岛海洋化工厂分厂),玻璃点样毛细管(华西医科大学仪器厂生产),紫外线分析仪(SHIMADZU UV-2201),电子天平(上海精天电子仪器有限公司)。

1.2 试剂 川归胶囊(规格：0.3 g/粒,北部战区总医院自制,批号：20201201、20201208、20201214),川芎对照药材(四川省维克奇生物科技有限公司,批号：ycwkq21052404),当归对照药材(中检所,批号：120927-201516),乙醚(天津市科密欧化学试剂有限公司),乙酸乙酯(天津市科密欧化学试剂有限公司),正己烷-乙酸乙酯(天津市科密欧化学试剂有限公司),十八烷基硅烷键合硅胶(Shimmer-pack C18),醋酸溶液(天津市科密欧化学试剂有限公司),阿魏酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号：0773-9910),甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司),水为纯化水,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 网络药理学预测分析

2.1.1 川归胶囊活性成分筛选及靶点预测 通过中药数据库ETCM (http：//www.tcmip.cn/ETCM/index.php),分别以“补骨脂”、“白鲜皮”、“川芎”、“当归”为关键词,获取川归胶囊的活性成分及其对应靶点信息,检索时间为2022年4月15日。分别收集到补骨脂、白鲜皮、川芎、当归的18、6、32、31个活性成分,合并去重后共得到77个活性成分,352个作用靶点。如图1所示。

2.1.2 白癜风疾病相关靶点的预测 在GeneCard(http：//www.genecards.org/)数据库、OMIM(https：//www.omim.org/)数据库中以“Vitiligo”为关键词检索白癜风的疾病靶点,检索时间为2022年4月24日。合并去重后共得到1 192个白癜风疾病的相关靶点。将疾病靶点与成分靶点信息映射构建维恩图,取交集共得到50个潜在靶点,结果见图2。

2.1.3 中药-活性成分-靶点网络构建及分析 将川归胶囊中中药、活性成分以及靶点导入到Cytoscape 3.9.1(https：//cytoscope.org/),构建“中药-活性成分-靶点”网络图,见图3。采用软件分析功能计算网络中节点的拓扑参数,以各个节点的自由度值(Degree)为主要评估标准,节点自由度值越大在网络图中则越重要。

取前10的节点,分别为二十四烷酸、阿魏酸、亚油酸、豆甾醇、肉豆蔻酸、补骨脂异黄酮、孕烯醇酮、菜油甾醇、谷甾醇、花翠素,作为川归胶囊治疗白癜风的核心成分。

图2 川归胶囊与白癜风靶点的维恩图

图3 川归胶囊中药-成分-靶点网络图

2.1.4 交集靶点蛋白互作网络的构建 将得到的药物与疾病共有的潜在治疗靶标信息输入String(http：//string-db.org/)数据库,物种设定为“Homo Sapiens”,得到川归胶囊治疗白癜风疾病潜在治疗靶点的PPI网络图。将得到的String数据库初始PPI网络图导入Cytoscape软件进行优化处理,删除孤立节点和连边后,共有48个节点,262条边,从拓扑分析参数得到ALB、AKT1、TNF、INS、IL-6、ESR1、TP53、IL-1β的自由度值远大于其他节点,故认为该8个靶点可能是川归胶囊治疗白癜风的关键靶点。结果见图4、图5。

2.1.5 基因本体(GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析 将50个白癜风疾病与成分的交集靶点输入到DAVID平台(https：//david.ncifcrf.gov/),以P≤0.05为筛选条件,进行GO分析和KEGG分析。GO分析得到共计806个条目。其中,生物学过程(BP)得到734个,主要涉及对激素水平的调节,炎症反应和细胞对脂质的反应等;分子功能(MF)得到56个,涉及氧化还原酶活性、核受体活性、配体激活的转录因子活性等;细胞组成(CC)得到16个,主要涉及分泌颗粒腔、转录复合体、受体复合物等。KEGG分析共得到123条信号通路,主要富集在PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、酪氨酸代谢、NOD样受体信号通路、JAK-STAT信号通路、TNF信号通路等。见图6、图7。

图4 川归胶囊治疗白癜风作用靶点PPI网络

图5 关键靶点PPI网络图

2.2 川归胶囊质量标准研究 川归胶囊为中药复方制剂,君药川芎和当归含量较高的主要活性成分为阿魏酸,因此,在质量标准中选用阿魏酸作为质量控制指标。

2.2.1 川芎、当归的鉴别 取本品粉末1 g,加乙醚20 ml,加热回流1 h,滤过,滤液挥干,残渣加乙酸乙酯3 ml使溶解,作为供试品溶液。再取川芎、当归对照药材各0.5 g,同法制成混合对照药材溶液。再取按处方比例制成的缺川芎、当归的阴性样品1 g,同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述供试品溶液与对照药材溶液各2 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性对照无干扰。结果见图8。

图6 川归胶囊治疗白癜风潜在靶点的GO富集分析

图7 川归胶囊治疗白癜风潜在靶点的KEGG信号通路分析

2.2.2 含量测定 ①色谱条件。色谱柱：Welchrom C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相：甲醇(A)-1%醋酸溶液(B),梯度洗脱(0～30 min,25%～30%A;30～45 min,30%～50%A);柱温：35 ℃;检测波长：323 nm;流速：1.0 ml/min;进样体积：10 μl。

图8 川芎、当归的薄层色谱

②溶液配制。对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品适量,精密称定,加甲醇制成每l ml含18 μg阿魏酸的对照品溶液。供试品溶液的制备：取川归胶囊0.6 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇溶液30 ml,称定重量,超声处理30 min,放冷,再称定重量,用70%甲醇溶液补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。阴性样品溶液的制备：按处方取除川芎、当归外的药材,按照制备工艺制成川归胶囊阴性样品,按供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。

③专属性试验。分别精密吸取阴性样品溶液、供试品溶液、对照品溶液各10 μl,按“2.2.2”项下色谱条件测定,记录色谱图。由图9可知,阴性对照样品不干扰阿魏酸的测定,阿魏酸与其他成分或杂质的分离度均大于1.5,表明此法专属性强。

图9 专属性HPLC图

④线性关系考察。取阿魏酸对照品适量,精密称定,用甲醇配制成浓度分别为1.77、3.54、8.84、17.68、35.36、70.72 μg/ml的对照品溶液。精密吸取上述浓度的对照品溶液各10 μl,按“2.2.2”项下色谱条件测定,测定各自峰面积,以对照品的浓度(μg/ml)为横坐标,峰面积值为纵坐标,求得回归方程Y=57 401X-82 248,r=0.999 9。结果表明,阿魏酸在浓度为1.77～70.72 μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。

⑤精密度试验。精密吸取对照品溶液10 μl,按“2.2.2”项下色谱条件分析,连续进样6次,记录色谱峰的峰面积。测得峰面积值的RSD为0.72%(n=6),≤2%,符合要求。

⑥稳定性试验。取同一批(批号：20200820)样品,取约0.6 g,精密称定,按“2.2.2”项制备供试品溶液,按“2.2.2”色谱条件分析,分别在0、2、4、6、8、10、12 h进样,测定样品中阿魏酸峰面积。峰面积值的RSD为2.50%(n=7),说明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

⑦重复性试验。取同一批(批号：20200820)样品,取约0.6 g(共6份),精密称定,按“2.2.2”项制备供试品溶液,按“2.2.2”色谱条件分析,测定每份样品中阿魏酸的含量。结果显示,样品中阿魏酸平均含量为0.48 mg/g,RSD为2.32%(n=6),符合要求。

⑧回收率试验。取同一批(批号：20200820)样品,每份取约0.3 g(共6份),精密称定,分别精密加入10 μl阿魏酸对照品溶液(19.68 μg/ml),称定重量,按“2.2.2”项制备供试品溶液,按“2.2.2”色谱条件分析,测定样品中含量,计算回收率。结果显示,平均回收率为102.06%,RSD为1.96%(n=6),符合要求,结果见表1。

表1 回收率试验结果(n=6)

⑨样品测定。取3批次川归胶囊样品,按“2.2.2”项制备供试品溶液,按“2.2.2”色谱条件分析,测定各自样品中阿魏酸的含量,结果见表2。3批川归胶囊中阿魏酸的平均含量为0.102 7 mg/粒。

表2 3批样品含量测定结果(n=2)

3 讨论

中医药理论认为,白癜风主要与气血瘀滞、风邪致病、肝肾不足、内热感邪学说相关[4]。中药复方制剂通常具有通过多个组分、多个靶点、多个通路来发挥治疗疾病作用的特点,使其对疾病作用机制的研究复杂。本研究通过对川归胶囊活性成分以及对应靶点的筛选,探讨川归胶囊治疗白癜风的关键作用基因和通路。

通过川归胶囊与白癜风疾病交集靶点的PPI网络表明,ALB、AKT1、TNF、INS、IL-6、ESR1、TP53、IL-1β在川归胶囊治疗白癜风疾病中发挥重要作用。TP53(细胞肿瘤抗原P53)蛋白可以使白癜风患者避免受到光化损伤,改变黑色素细胞迁移能力,从而改善患者色素沉着[5]。白细胞介素会影响黑色素细胞的生理作用,导致体内黑色素作用异常[6],进而使患者患病。白癜风患者血液中IL-6水平增加将使免疫成分汇集到皮肤,导致黑色素细胞被靶向破坏,IL-6就可以解决这个问题。AKT1是RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可以抑制β连环素的降解,导致小眼症相关转录因子(MITF)和酪氨酸酶被激活,从而促进黑色素合成[7]。TNF可通过各种途径诱导人黑色素细胞凋亡[8],因此在白癜风的治疗中可应用TNF拮抗剂。这些结果表明,川归胶囊可以从不同层面解决白癜风疾病相关因素的异常,从而达到治疗白癜风的目的。

KEGG富集分析结果表明,川归胶囊治疗白癜风可以由多条不同的通路共同完成,主要富集在肿瘤坏死因子信号通路、PI3K-Akt信号通路、NOD样受体信号通路、JAK-STAT信号通路等。肿瘤坏死因子 (TNF-α)是一种多向性的促炎性单核细胞因子,主要由单核细胞和巨噬细胞产生,能够起到激活角质形成其他炎症介质的作用[9],能够抑制黑色素细胞的增生及黑色素生成,影响黑色素细胞的凋亡,同时参与白癜风发病的免疫调控[10]。PI3K在持续活化的同时,能抑制黑色素细胞产生凋亡,在一定程度上加快了黑色素细胞发生凋亡的速度。所以,在氧化应激诱导的黑色素细胞损伤中,PI3K-Akt信号通路起到了重要作用。中药网络药理学以系统生物学、网络信息学、生物信息学等多个学科理论为基础,将生物分子间复杂的相互作用和疾病相关靶点相关联,构建中药成分或组分-靶点-疾病相关生物分子网络模型,进而阐述药物与机体的作用机制,具有整体性、系统性、动态性特点,倡导多靶点、多途径的药物分析和评价原则,与传统中医中药诊断和治疗疾病的原理殊途同归。近年来,网络药理学在中药研究中具有长足发展,可用于预测中药作用靶点、预测与辨识中药活性成分群、阐明中药作用机制、科学解释组方的规律、发现新的适应证等[11-12]。然而,网络药理学对中药化学成分、基因靶点和信号通路的选择主要依赖于对文献和公共数据库的分析,缺乏针对性,且缺少对“量”的考量,忽略了药物的量效关系,无法体现出各有效成分含量上的差异。将所有成分同等对待,研究其可能的作用靶标和作用机制存在一定的不合理性。因此,为了提高结果的可靠性,课题组将针对核心成分和靶点进行后续的研究验证。

本文通过网络药理学系统分析可知,二十四烷酸、阿魏酸、亚油酸、豆甾醇、肉豆蔻酸、补骨脂异黄酮、孕烯醇酮、菜油甾醇、谷甾醇、花翠素是川归胶囊治疗白癜风的主要活性化合物。研究发现,阿魏酸能够通过调控Nrf2/HO-1信号通路、PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路和抑制NF-κB/TNF-α轴发挥抗氧化和抗炎作用[13-15]。补骨脂异黄酮通过降低pro-caspase-1自我剪切活化,从而降低NLRP3、NLRC4、AIM2炎症小体的活性,进一步抑制免疫炎症反应[16]。豆甾醇通过调节MAPK3和PRKACA的表达水平,在一定程度上发挥抗炎作用[17]。

能发挥活血、行气、祛风和止痛等功效[18],而当归性味为甘、温、辛,具有补血活血、抗炎和增强免疫等功效[19],二者为临床上常用的配伍药材。近年来国内外有关川芎和当归的研究日渐深入,发现川芎中化学成分主要有挥发油(如藁本内酯、3-丁基苯酞)、生物碱(如川芎嗪、川芎碱B)、有机酸(如棕榈酸和阿魏酸)、多糖等,对心脑血管系统、肝肾系统、神经系统、呼吸系统等都具有多方面的药理活性,主要表现为镇痛、抗炎、抗氧化能力、抗衰老、细胞保护、改善心功能等作用[20-23]。从当归中分离出的化学成分主要包括挥发油、有机酸类、多糖以及黄酮等。阿魏酸是有机酸类的代表,是当归质量控制的重要指标之一。当归对造血系统、心血管系统、免疫系统均有良好的药理作用[24-25]。

川芎、当归在多系统、多器官及多种疾病的临床治疗中具有重要意义,且二者共同的有效成分主要为阿魏酸。目前,关于含有川芎或当归的制剂以阿魏酸为质控成分的含量测定较多[26-28],且多数为高效液相等度洗脱,但因川归胶囊为中药复方制剂,供试品溶液经制备后所得到的成分较多,等度洗脱无法使阿魏酸达到基线分离,因此,该研究中的含量测定方法采用梯度洗脱,经多次摸索后确定了梯度洗脱的程序。该方法简单准确、稳定可靠,可用于川归胶囊的质量评价。

本研究以网络药理学筛选的核心成分—阿魏酸作为川归胶囊质量标准中新的指标成分,建立了阿魏酸的薄层色谱鉴别方法和HPLC含量测定方法。该方法具有较好的专属性和重现性,提升了川归胶囊的质量标准,为川归胶囊的临床应用和后期医院制剂的研发提供理论依据。