不同猕猴桃品种溃疡病抗性及其与枝条含糖量的关系*

高建有,匡美美,罗 庆,谭泽成,崔丽红,查满荣,刘世彪

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南 吉首 416000;2.湘西民族职业技术学院,湖南 吉首 416000)

猕猴桃(Actinidiachinensis)为营养丰富、富含维生素C的新兴特色水果,在我国发展极快.猕猴桃细菌性溃疡病是危害猕猴桃产业发展的严重病害.该病首次发现于湖南省东山峰农场[1],由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidiae,Psa)引起,可导致猕猴桃叶出现叶斑、花芽/叶芽褐变和脱落、果实皱缩、枝条顶端枯死甚至整株死亡等症状[2].溃疡病具有爆发突然、易复发、传播迅速、毁灭性强和难以根除等特点,已成为猕猴桃的“癌症”.人们从不同角度探讨了猕猴桃的抗病表现,如韩明丽等[3]认为树体营养积累情况与溃疡病抗性强弱有关;李淼等[4]认为枝条皮孔长度、密度与品种抗病性相关.筛选和种植抗病品种是降低发病率的主要措施之一,目前已经报道了多个抗性较强的品种[5-6].

湘西为湖南省猕猴桃主产区,主要栽培品种为“米良一号”,兼植其他多个品种.近20年来溃疡病在该区屡有发生,且部分果园病情极为严重[7].为此,本研究采用枝条致伤接菌法检测了中华猕猴桃和美味猕猴桃13个栽培品种的溃疡病抗性,测定了各猕猴桃品种的枝条皮孔性状、可溶性糖和还原糖含量,以分析枝条含糖量与溃疡病的关系,旨在为猕猴桃抗病性评价和抗病机理探讨提供参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料

5年生中华猕猴桃(A.chinensis)品种“翠玉”“武植三号”“贝木”“金艳”“湘吉红”“红阳”“楚红”“东红”,以及美味猕猴桃(A.chinensisvar.deliciosa)品种“米良一号”“米良二号”“湘碧玉”“湘吉”“贵长”共13个栽培品种,种植于吉首大学和湘西民族职业技术学院果园,管理水平一致.

猕猴桃溃疡病菌株为P.syringaepv.actinidiastr. shaanxi-M228 (GCA 000344475.2),由湘西民族职业技术学院植物病理学实验室提供.

1.2 实验方法

1.2.1 接种方法 (1)菌株培养方法.将致病菌株M228接种于溶菌肉汤固体培养基上,于25 ℃下培养36 h.挑取单菌落到LB液体培养基中,于25 ℃,180 r/min摇床上培养24 h后,在6 500 r/min的离心机中离心5 min,收集菌体,备用.

(2)离体枝条接种.参照Zhao等[8]方法配置菌悬液并稍作改变.收集菌体,用无菌水配置成吸光度值为0.2的菌悬液待用.采集一年生猕猴桃枝条,取中间部分(直径8 mm,长15 cm),用质量分数为0.6%的次氯酸钠溶液表面消毒15 min,无菌水冲洗3～4次,每次10 min,自然晾干后,用石蜡将两端切口封口.用无菌美工刀在枝条中间部位划伤树皮至木质部(宽1 mm),用10 uL移液枪向切口处注入10 uL菌悬液,静置15 min,待菌液从木质部渗入.每种供试枝条30个.在底部贴2层无菌滤纸的无菌托盘中加入无菌水保持湿度,上置无菌培养皿,将接种后的枝条摆放在培养皿上,切口朝上,每培养皿中5个枝条,用保鲜膜将托盘封口,置于光照和黑暗时段比16 h/8 h、昼夜温度比16℃/10℃的光照培养箱中.

1.3 枝条性状观测

1.3.1 皮孔数量及皮层厚度测定 实验当天(0天)随机选取1个培养皿中5个枝条,用美工刀在枝条中间部位剥下长5 cm的一圈树皮,观察其皮孔排列方式,记录皮孔数目,计算皮孔密度.用游标卡尺测量皮孔长度和皮层厚度,取平均值分析.

1.3.2 病斑长度测定及抗性等级评价 分别于接种M228后5,10,15,20,25 d随机取样,每次选取1个培养皿中5个枝条,用美工刀剥去皮层后,观察木质部褐变程度,并用游标卡尺测量病斑长度.

抗性评价参照温欣[9]方法略作调整.根据病斑长度将抗病性划分为“高抗”“抗”“中抗/中感”“感”“高感”5个等级.高抗：韧皮部仅在接种处出现长度小于5 mm的褐变,且褐变不明显.抗：接种处附近5～10 mm出现褐变,且有局部组织坏死.中抗/中感：伤口附近10～20 mm处发生褐变,且有木质部局部褐变.感：伤口附近20～30 mm发生褐变,且有局部木质部褐变.高感：局部褐变范围超过30 mm,且木质部发生显著褐变.每次以5个枝条病斑长度平均值评价抗病性,以第25天观察结果为最终依据.

1.3.3 皮层的含糖量测定 (1)皮层取样.将第0天用于皮孔数量及皮层厚度测定后的5个离体枝条,以及第25天病斑测定后的5个离体枝条,用无菌美工刀刮去枝条周皮,以接菌口为中点向两端各削取2.5 cm长皮层,测定皮层的糖含量,取平均值分析.

(2)可溶性糖和还原糖的测定.采用乙醇提取法、蒽酮比色法和3,5-二硝基水杨酸比色法,测定接种枝条皮层中的可溶性糖和还原糖含量.

1.4 数据分析

采用SPSS软件对各品种的病斑长度、皮孔长度、皮孔密度和皮层厚度进行差异显著性比较,将皮孔长度、皮孔密度、皮层厚度、枝条含糖量与病斑长度(抗病性)作相关性分析.

2 结果

2.1 不同猕猴桃品种的溃疡病抗性

8个中华猕猴桃栽培品种在接种病原菌后25天期间的病斑长度如图1(a)所示.由图1(a)可知：接种后5天均未检出病斑,第10天除“翠玉”和“楚红”外,均有病斑出现,以“红阳”病斑最长.病斑随观测时间延长而加长,其中“红阳”的病斑在所有受试品种中一直保持最长.第15天时“贝木”病斑长度升到第二,“楚红”病斑最短.第20天时“贝木”和“湘吉红”病斑长度仍较高,“楚红”最短.第25天时“红阳”病斑长度达37.43 mm,显著高于其他品种病斑长度,“东红”虽然在前期病斑较小,但在25天时病斑长度急剧上升至25.57 mm,位居第二,反映出病菌具有较长潜伏期和急剧爆发性特点.“贝木”“湘吉红”“金艳”和“武植三号”的病斑长度相差较小,均显著低于“红阳”和“东红”.“翠玉”和“楚红”发病迟、病斑小,表现出较强抗病能力.根据溃疡病枝条抗性评价标准,中华猕猴桃8个品种的抗病性由强到弱依次为“楚红”(抗)、“翠玉”(抗)、“贝木”(中抗/中感)、“湘吉红”(中抗/中感)、“武植三号”(中抗/中感)、“金艳”(中抗/中感)、“东红”(感)、“红阳”(高感).

图中相同培养时间不同小写字母代表相同培养时间不同品种间差异显著(P<0.0.5).图1 猕猴桃栽培品种离体枝条病斑长度Fig.1 Disease Spot Length on Isolated Branch of Kiwifruit Cultivars

5个美味猕猴桃栽培品种在接种病原菌后25天内的病斑长度变化如图1(b)所示.由图1(b)可知：前5天所有品种均未发病,第10天“贵长”病斑明显,其后一直均为最长.第10天“湘碧玉”出现病斑,第15天所有品种均出现病斑.第20天时“湘吉”与“湘碧玉”的病斑长度等长,均高于“米良一号”和“米良二号”.第25天时“贵长”褐斑达27.25 mm,显著高于其他品种,表现出高感特性;“湘吉”和“湘碧玉”的感病现象也较明显,而“米良一号”和“米良二号”不仅发病较晚,其在第25天时的病情也较轻,表现出较强的抗病性.

综上,13个栽培品种的抗病性由强到弱依次为“米良一号”(高抗)、“米良二号”(抗)、“楚红”(抗)、“翠玉”(抗)、“贝木”(中抗/中感)、“湘碧玉”(中抗/中感)、“湘吉”(中抗/中感)、“湘吉红”(中抗/中感)、“武植三号”(中抗/中感)、“金艳”(中抗/中感)、“东红”(感)、“贵长”(感)、“红阳”(高感).

2.2 猕猴桃枝条皮孔性状和皮层厚度与溃疡病抗性

13个猕猴桃品种枝条的皮孔和皮层性状如表1所示.由表1可知：各品种在皮孔密度、皮孔长度、皮孔排列方式及皮层厚度上存在较大差异.“湘吉”皮孔密度最少,仅为2.4个/cm2,“湘碧玉”皮孔密度最大,高达14.4个/cm2.“贵长”皮孔长度最短,仅为0.66 mm,以“红阳”皮孔长度最长,为2.672 mm.“楚红”皮层厚度最小,为0.49 mm,“红阳”皮层厚度最大,为1.1 mm.相关性分析显示,13个品种的皮孔长度、皮孔密度和皮层厚度与各自溃疡病抗性的相关系数分别为0.284,0.707和0.490,表明这些指标与溃疡病抗性没有明显相关性.

表1 猕猴桃枝条皮孔和皮层性状Table 1 Characters of Lenticel and Cortex in Branches of Kiwifruit Cultivars

2.3 猕猴桃枝条含糖量与溃疡病抗性

2.3.1 可溶性糖与溃疡病抗性 可溶性总糖包括葡萄糖、果糖和蔗糖等,是植物重要的碳水化合物,也是细菌生存的能量来源.枝条皮层中的可溶性糖含量变化可能反映感病后猕猴桃维持生存的能量变化动态.中华猕猴桃处理前后枝条可溶性糖含量变化如图2(a)所示.由图2(a)可知：8个品种枝条可溶性糖含量随感病时间增长均呈现出下降趋势.猕猴桃枝条感病前可溶性糖含量大致可分为两组：高糖组(16 mg/g以上)有“楚红”“湘吉红”“武植三号”和“红阳”;低糖组(16 mg/g以下)有“东红”“贝木”“翠玉”和“金艳”.处理25天后按枝条可溶性糖含量亦可将猕猴桃分为两组：高糖组(12 mg/g以上)有“湘吉红”“楚红”“武植三号”和“翠玉”;低糖组(12 mg/g以下)有“贝木”“东红”“红阳”和“金艳”.其中有6个品种的枝条可溶性糖含量维持在原来组别,“红阳”感病后由高糖组急剧下降至低糖组,“翠玉”则由低糖组急剧上升至高糖组.与图1(a)中病斑大小作相关性分析,发现总体趋势为感病后高糖组的溃疡病抗性相应较强(“楚红”(抗)、“翠玉”(抗)、“湘吉红”(中抗/中感)、“武植三号”(中抗/中感)),而低糖组抗病性相对较弱(“贝木”(中抗/中感)、“金艳”(中抗/中感)、“东红”(感)、“红阳”(高感)).经相关性分析,接菌前、后的枝条可溶性糖含量与抗性的相关性系数分别为0.641和-0.202,虽未达到显著水平,但大概率反映了感病植株营养状况与抗病性的关系,尤以抗病的“楚红”和“翠玉”,感病和高感的“东红”和“红阳”最为明显.

图2 猕猴桃品种枝条的可溶性糖含量变化Fig. 2 Content of Soluble Sugar in Branches of Kiwifruit Cultivars

美味猕猴桃处理前后枝条可溶性糖含量变化如图2(b)所示.由图2(b)可知：5个美味猕猴桃品种枝条处理25天后,可溶性糖含量同样呈下降趋势.感病前枝条可溶性糖含量以“米良二号”最高,“贵长”最低,“米良一号”和“湘碧玉”高于“湘吉”.感病25天时各品种可溶性糖含量仍保持上述顺序.与图1(b)中病斑大小作相关性分析,也显示出感病后可溶性糖含量较高的品种抗病能力较强,可溶性糖含量较低的品种抗病能力较弱(“米良一号”(高抗)、“米良二号”(抗)、“湘碧玉”(中抗/中感)、“湘吉”(中抗/中感)、“贵长”(感)).中华猕猴桃与美味猕猴桃相比,前者大部分品种枝条的含糖量在感病前后高于后者,且前者在感病期间的下降程度略高于后者.

2.3.2 还原糖与溃疡病抗性 中华猕猴桃处理前后枝条还原糖含量变化如图3(a)所示.由图3(a)可知：8个品种枝条还原糖含量随感病时间增长总体呈上升趋势.感病前枝条还原糖含量在3 mg/g以上的高糖组有“楚红”“武植三号”“东红”和“红阳”,3 mg/g以下的低糖组有“湘吉红”“翠玉”“金艳”和“贝木”.感病25天时,除“楚红”枝条还原糖含量下降外,其余品种枝条还原糖含量均上升,以“金艳”最高,“红阳”最低.美味猕猴桃处理前后枝条还原糖含量变化如图3(b)所示.由图3(b)可知：5个品种枝条经过处理后,还原糖含量同样呈上升趋势,感病前枝条还原糖含量以“湘碧玉”最高,“贵长”最低,感病25天时以“湘吉”最高,“湘碧玉”最低.相关性分析显示,接菌前、后枝条还原糖含量与抗性的相关性系数分别为0.831和0.785,说明各品种枝条还原糖含量与溃疡病抗性无明显相关性.

3 讨论

猕猴桃溃疡病是威胁猕猴桃生产的毁灭性病害,虽然研究者对Psa的致病机理和抗病分子机理已取得一些研究成果[10-12],并开发出一些防治措施[13-15],但选用抗性品种仍是目前预防该病最有效和实用的方法,而其前提则是对现有品种抗病性进行充分的了解和评价.不同猕猴桃品种对Psa的敏感程度不同,王发明等[16]对9个红肉猕猴桃品种的溃疡病抗性分析显示,“楚红”的抗性较强.本研究结果支持这一结论,中华猕猴桃中“翠玉”不仅在室内表现为抗性较强,在田间也表现出较强抗病性[7].张慧琴等[17]通过室内离体接种方法探究了18个不同猕猴桃品种的抗病性,发现中华猕猴桃和美味猕猴桃各受试材料之间的抗病性差异较大.“米良一号”是湘西地区猕猴桃主栽品种,本研究发现其在室内具有较高的抗病性.此外,“米良一号”在中低海拔地区也具有较强的抗寒性和抗旱性,但近年有研究报道,生产园的“米良一号”也有溃疡病发生,这与海拔、低温、降雨和管理水平直接相关[7,18].因此,预防猕猴桃溃疡病要考虑包括品种抗病性在内的综合因素.

学者们很感兴趣能否从枝条形态特征快速判断猕猴桃溃疡病抗病性强弱.李淼等[4]报道猕猴桃抗病性与枝条皮孔大小和密度成正相关,皮孔分布密集且上下排列成直线的品种容易感病,而分布稀疏排列随机的品种则不易感病.本研究结果显示,猕猴桃的抗病性与皮孔密度、长度、排列方式和皮层厚度并无明显相关性.虽然Psa可通过皮孔、气孔等开口入侵,但在自然条件下Psa受皮孔密度和排列方式制约的机率应是极小的,更大机率是从冬季修剪伤口入侵.

糖类是猕猴桃生存的能量储存和转移介质,是抗逆性强弱的基础,是Psa代谢的能量来源,也是树体和病原菌争夺的代谢底物.李淼等[19]报道,发病后猕猴桃枝条的可溶性糖含量均降低,但感病品种的枝条可溶性糖含量显著下降.本研究发现,感病后猕猴桃枝条的可溶性糖含量降低,且糖含量降低后仍维持在较高水平的品种,其抗病性较强;反之,枝条可溶性糖含量降低至较低水平的品种,其抗病性较弱,这与笔者最近发表的敏感和高感猕猴桃在接种溃疡病菌后蔗糖含量下降更多的观点是一致的[20].尤其是抗病性最弱的“红阳”品种,感病前枝条可溶性糖含量较高,而感病后枝条可溶性糖含量较低,其原因可能在于病情发展过程中Psa要消耗大量糖分,植株为维持自身代谢、增强“免疫力”也需要消耗更多能量,致使糖源供应不继而病情加重.本研究中,13种猕猴桃品种枝条还原糖含量变化与可溶性糖含量变化基本呈相反趋势,感病后枝条还原糖含量呈增加态势,但含量大小与抗病性强弱并无明显关系.究其原因,还原糖不仅能为植物提供能源,可能也会作为一种信号物质行使微量高效的调节作用,或者较高的还原糖含量更有利于病原菌的快速繁殖,其机制有待进一步研究.