当归芍药散及其拆方对动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠血小板聚集率及内皮细胞粘附分子的影响

鹿艺星 孙月蒙 孙燕 宗毓麟 闫淑鑫 骈雪 高誉珊 李宇航

动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是冠心病、高血压、高脂血症等心脑血管疾病的共同病理基础,主要表现为血管内皮受损、细胞粘附分子(cell adhesion molecules, CAMs)表达上调、诸多炎症因子和脂质浸润、巨噬细胞、平滑肌细胞等在血管内大量聚集、血管壁失去弹性、类黄色粥样斑块形成[1-3],多累及中、大动脉。全球每年死于AS相关疾病人数高达2000 万,严重威胁着全人类的生命健康[4]。目前现代医学治疗AS药物较多,主要以他汀类为代表,但长期使用导致肝肾损伤等诸多安全问题[5]。中医药在治疗AS上具有作用缓和、疗效持久、安全性高、副作用少等优势[6]。因此,开展传统中医药治疗AS的实验研究以及临床试验有潜在的发展前景。

当归芍药散是《金匮要略》经典方剂,具有活血散瘀、养血和血功效,符合AS痰浊内生、痰瘀互结于脉道的证候特点,广泛应用于临床且疗效确切[7-8]。近年来医学界越来越关注活血散瘀法治疗AS的分子机制,多把血管粘附分子和血小板活化[9]作为血瘀证生成发展过程中重要的客观依据。因此,本研究基于方证对应理论[10-11],从当归芍药散复方中拆分出单个方剂要素进行分析,以血小板聚集率和血管内皮细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)为切入点,研究当归芍药散及其拆方对ApoE-/-模型小鼠血小板聚集率和血管内皮粘附因子的影响,探讨对AS的防治作用,以期为临床提供思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通C57BL/6J 小鼠12 只;SPF级雄性C57BL/6J ApoE-/-小鼠72 只,6～8 周龄,体质量(20±2)g,均购于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2016-0006]。饲养于北京中医药大学良乡校区动物房独立通气笼系统,室内温度(25±2)℃,相对湿度40%～60%,12 小时明暗交替,自由进食与饮水。所有实验方案得到北京中医药大学动物伦理委员会的批准(批号:BUCM-4-2021060802-2056)。

1.2 实验药物及制备

(1)当归芍药散[12]组成:当归9 g、川芎24 g、白芍48 g、茯苓12 g、白术12 g、泽泻24 g;(2)柔肝缓急组:白芍48 g;(3)健脾化浊组:茯苓12 g、白术12 g、泽泻24 g;(4)活血散瘀组:当归9 g、川芎24 g。中药购自北京同仁堂京西药店有限公司,并由北京中医药大学中医学院中医药基础理论与关键技术研究中心鉴定为正品。(蒸馏水浸泡中药30 分钟,武火煮沸后使用文火煎煮30 分钟,提取药液。再加入蒸馏水重复煎煮,去滓,将两次提取的药液混合,进行水浴蒸发浓缩,使用200目过滤网过滤制备中药液,置于4℃冰箱中储存以灌胃给药。阿托伐他汀钙片磨成粉末,使用蒸馏水制备成2 mg/mL悬浮液,置于4℃冰箱中保存备用。

阿托伐他汀钙组:阿托伐他汀钙片,由辉瑞制药有限公司(美国,纽约)提供,批号:H20051408,规格:20 mg/片。

1.3 主要试剂与仪器

4%多聚甲醛(OUBEI,OB10341-1);PBS缓冲液干粉(百瑞极,BN20220-L);粉剂型抗原修复液(迈新,MVS-0066);DAB显色试剂盒(迈新,2109290031H);即用型免疫组化染色试剂盒(迈新,2108029706C);ICAM-1 Rabbit PolyAb兔多克隆抗体(proteintech,10020-1-AP);VCAM-1 Rabbit mAb兔多克隆抗体(Cell Signaling Technology,D2T4N);无水乙醇(国药集团,10009218);二甲苯(国药集团,10023418);氯化钠溶液(OUBEI,OB20926);改良油红O染色液(索莱宝, G1261)。

独立通气笼IVC饲养笼(江苏,苏杭科技器材有限公司);AL204电子天平(上海,梅特勒托利多仪器有限公司);正置显微镜(德国Leica,DM4B);YD-6L生物组织包埋机(金华市,益迪医疗设备有限公司);电热恒温培养箱(天津市,中环实验电炉有限公司);电热鼓风干燥箱(上海,恒科学仪器有限公司);普通体式显微镜(日本,SWZ745T);THZ-D台式恒温振荡器(太仓市,实验设备厂);血小板聚集仪(美国,CHRONO-LOG)。

1.4 分组及给药

小鼠适应性喂养7 天后,将12 只普通C57BL/6J小鼠作为空白对照组,给予普通饮食饲养。72 只ApoE-/-小鼠给予高脂饮食(含15%猪油、2%胆固醇、0.05%胆酸,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供)随机分为模型组、当归芍药散组、柔肝缓急组、健脾化浊组、活血散瘀组和阿托伐他汀钙组,每组12 只。连续16 周,建立动脉粥样硬化模型。

生药剂量比例参照《方剂学》[12],根据“人与动物间按体表面积折算的等效剂量比值表”折算[13],从实验第一天开始给每组动物进行预防给药,灌胃时间连续16 周,当归芍药散组、柔肝缓急组、健脾化浊组和活血散瘀组日给药剂量分别为:16.77 g/kg、6.24 g/kg、6.24 g/kg、4.29 g/kg,阿托伐他汀钙片组给药剂量为5 mg/kg。小鼠给药体积为0.2 mL/10 g,模型组和正常组给予等体积蒸馏水。

1.5 取材与检测指标

1.5.1 样本采集 在实验第16 周结束,末次给药后12 小时,禁食不禁水。记录小鼠体质量等一般情况,腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉。采用眼球取血法收集约1～1.5 mL血液,各组随机选取6 只小鼠眼球取血后将血液置于含0.1%肝素钠的1.5 mL抗凝管中以检测血小板聚集率,另外6 只小鼠眼球取血后将血液置于1.5 mL离心管中,用于血脂检测;取血后在普通体式显微镜下开胸分离主动脉弓至髂动脉分叉处,清除外膜脂肪组织,用PBS缓冲液进行冲洗直至由红色变成无色透明,完成整个主动脉剥离并进行拍照,置于4%多聚甲醛中固定备用。小鼠主动脉血管取材后,分别以每组6 只环切(血管垂直放入)、另外6 只纵切(血管水平放入)的方式,置于装好OCT包埋剂的离心管内,并将主动脉血管在离心管内的位置用标记笔大致标出。

1.5.2 主动脉油红O染色 取6 只环切的主动脉血管,按标记笔标记的位置进行修片,自出现血管组织开始,以10 μm厚度,每切三次取一张,连续留片,按照改良油红O试剂盒说明书进行染色。使用正置显微镜拍摄血管切片染色,以观察动脉粥样硬化斑块面积大小。用Image-Pro Plus 6.0软件对AS斑块进行标注和测量,计算斑块面积与管腔面积比值,并评估AS模型是否成立以及各给药组的干预效果。计算公式:斑块面积占比=斑块面积/管腔面积。

1.5.3 血小板聚集率检测 将每组6 只小鼠血液置于含0.1%肝素钠的1.5 mL抗凝管中,采用比浊法在血小板聚集仪上进行血小板聚集率的检测。

1.5.4 活血散瘀疗效评价 采用Image-Pro Plus 6.0软件对小鼠纵切血管图片进行分析,计算非斑块面积与血管纵切总面积的比值,得出非斑块面积率,然后除以血小板聚集率,给予活血散瘀疗效评价。计算公式:活血散瘀疗效评价=(纵切血管总面积-纵切斑块面积)/纵切血管总面积/血小板聚集率。

1.5.5 血管内皮粘附因子水平 每组取另6 只纵切主动脉血管用于分子生物学检测,按照试剂说明书步骤采用SP法检测,ICAM-1、VCAM-1抗体分别用PBS按1∶280、1∶50比例稀释,光镜下观测小鼠主动脉血管内皮粘附因子的表达。采用ImagePlus 6.0图像分析软件对免疫组化切片阳性表达区域的积分吸光度进行测定,计算平均吸光度(积分吸光度/主动脉横截面积),以平均吸光度表示血管内皮粘附因子在主动脉中的表达强度。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况

实验干预16 周后,正常组小鼠形体适中,反应灵敏,活动自如,毛色光亮,纳食佳,大小便均正常;模型组小鼠形体偏胖,反应较迟钝,毛色较正常组小鼠晦暗且有脱落现象,纳食较多,大便稍硬,小便正常;当归芍药散组小鼠形体适中,反应灵敏,活动度较好,毛质光亮顺滑,神态安详,纳食佳,大小便正常;柔肝缓急组小鼠较模型组小鼠偏瘦,反应稍灵敏,活动度良好,毛色较差,纳食减少,大便稍软,小便正常;健脾化浊组小鼠形体偏瘦,反应较为灵敏,活动度较好,毛质顺滑有光泽,纳食佳,大便软,小便正常;活血散瘀组小鼠形体偏瘦,反应较灵活,活动度好,毛质顺滑有光泽,纳食如常,大便稍软,小便正常;阿托伐他汀钙组小鼠形体适中,反应敏捷,毛质光亮顺滑,精神略躁,纳食欠佳,大小便均正常。

2.2 各组小鼠主动脉油红O染色结果

与正常组相比,模型组小鼠主动脉处斑块堆积明显增多,差异有统计学意义(P<0.05),证明AS造模成功;与模型组相比,各给药组小鼠斑块面积占比均不同程度减小,组间差异有统计学意义(P<0.05)。斑块面积占比顺序依次为:当归芍药散组<活血散瘀组<健脾化浊组<阿托伐他汀钙组<柔肝缓急组。与当归芍药散组比较,其余给药组斑块面积显著变大(P<0.05);与活血散瘀组比较,柔肝缓急组与阿托伐他汀钙组斑块面积显著变大(P<0.05)。见图1、表1。

注:A正常组;B 模型组;C 当归芍药散组;D 柔肝缓急组;E 健脾化浊组;F 活血散瘀组;G 阿托伐他汀钙组。

表1 各组小鼠斑块面积占比

2.3 各组小鼠血小板聚集率比较

与正常组比较,模型组血小板聚集率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,给药组小鼠血小板聚集率均降低,其中当归芍药散组和活血散瘀组血小板聚集率显著降低,组间差异有统计学意义(P<0.05)。各拆方组中,活血散瘀组降低血小板聚集率作用好,健脾化浊组次之,柔肝缓急组再次之,且与活血散瘀组比较,两拆方组均有统计学差异(P<0.05)。与当归芍药散组比较,柔肝缓急组、健脾化浊组与阿托伐他汀钙组血小板聚集率显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠血小板聚集率检测

表3 各组小鼠活血散瘀疗效评价

2.4 各组小鼠活血散瘀疗效评价

与正常组比较,模型组活血散瘀疗效评价低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,各给药组小鼠疗效评价均升高,顺序依次为:柔肝缓急组<健脾化浊组<阿托伐他汀钙组<活血散瘀组<当归芍药散组。其中当归芍药散组和活血散瘀组纵切非斑块面积占比高,血小板聚集率数值小,活血散瘀疗效评价好。与当归芍药散组比较,柔肝缓急组、健脾化浊组与阿托伐他汀钙组疗效评价水平显著降低(P<0.05);与活血化瘀组比较,两拆方组与阿托伐他汀钙组疗效评价显著下降(P<0.05)。见表 3。

2.5 各组小鼠免疫组化染色结果

ICAM-1和VCAM-1在血管内皮集中表达,其阳性免疫反应产物呈棕黄色细颗粒状。与正常组比较,模型组ICAM-1和VCAM-1在主动脉内皮表达显著增多,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,各给药组ICAM-1和VCAM-1表达均减少,组间差异有统计学意义(P<0.05)。其中当归芍药散组干预ICAM-1和VCAM-1效果最好,活血散瘀组次之。与当归芍药散组比较,柔肝缓急组、健脾化浊组ICAM-1表达显著升高(P<0.05)。与活血化瘀组比较,柔肝缓急组、健脾化浊组ICAM-1表达显著升高(P<0.05)。见表4、图2、图3。

注:A正常组;B 模型组;C 当归芍药散组;D 柔肝缓急组;E 健脾化浊组;F 活血散瘀组;G 阿托伐他汀钙组。

注:A正常组;B 模型组;C 当归芍药散组;D 柔肝缓急组;E 健脾化浊组;F 活血散瘀组;G 阿托伐他汀钙组。

表4 小鼠免疫组化粘附因子平均光密度值比较

3 讨论

中医学无动脉粥样硬化的病名,根据临床表现可归属为 “胸痹”“心痛”“脉积”等范畴。患者先天禀赋不足或后天失养,五脏受损,脾胃运化水谷津液功能障碍,产生痰浊、血瘀等病理产物,易结聚成块阻滞脉道,血行不利,发为癥瘕。中医认为瘀血贯穿AS发病始终[14],多采用活血散瘀法治疗[15]。现代药理学表明具有活血散瘀功效的中药可以调节血流动力学、改善血管通透性、减少内皮细胞破损、通过对血小板和血管平滑肌细胞的影响,抑制血栓及减缓斑块形成,改善AS临床表现[16]。

近年来关于中医证候的研究取得了极大进展,“证候要素”“方剂要素”和“方证要素对应”的相继提出, 对于发展规范化、 科学化的中医辨证论治体系具有重要价值[17-19]。以往研究当归芍药散拆方多从君臣佐使或者药物功效(血药、水药)进行简单划分[20-23],多体现药物配伍的主从关系或者是等级结构,临床使用该方时须与本病机一致。然而患者病机往往是复杂的, 很难找到完全相符患者情况的方剂。而“方证要素对应”的组方原则是针对关键证候要素给与相对应的方剂要素,使组方药物靶向更加明确,更加强调理法方药的逻辑关系。临证时抽取相对应的名方“组件”即可灵活使用,使得组方药味多而不杂,少而义明。因此,本实验运用“方证要素对应”的中医组方原理对AS的证候要素进行分析,分别为:筋脉拘挛、脾虚痰浊内生、痰瘀互结,并与当归芍药散的方剂要素“柔肝缓急”“健脾化浊”“活血散瘀”一一对应。本实验结果显示,活血散瘀组较其他拆方组在减小斑块面积、降低血小板聚集率和调节内皮细胞粘附分子方面效果好,其方剂要素由当归和川芎组成,当归味甘性辛,甘能补血,辛能行能散,辛散之力推动气血周流以养血活血,为血中圣药;川芎辛温走窜,为血中气药,能活血行气、调气散瘀。二者润燥相宜,相须为用,养血不致滋腻,祛瘀生新而不伤气血。在临床上常配伍使用发挥养血和血、活血化瘀的功效。

AS是一种慢性血管性炎症反应疾病,血管内皮细胞结构和功能的变化是AS发生发展的始动环节。ICAM-1和VCAM-1属于免疫球蛋白超家族类,可以增强单核细胞的粘附和转移能力,促进单核细胞向巨噬细胞、泡沫细胞的转化[24]。同时体内表达过多的血管内皮粘附因子也是形成血栓的重要原因[25-26]。研究发现冠心病血瘀证患者血清中ICAM-1、VCAM-1存在高水平表达是衡量瘀血的有效敏感指标[27-28]。本实验结果表明,当归芍药散组与活血散瘀组可有效抑制或下调ApoE-/-小鼠主动脉内皮ICAM-1和VCAM-1表达,从而减轻AS。此外,血小板大量聚集可促进AS脂质斑块的形成和发展。其机理是单核细胞吞噬由血小板产生的富含脂质的颗粒,最终发展成含较多泡沫细胞的脂质斑块[29]。本研究表明当归芍药散及其拆方均能降低血小板聚集率,以活血散瘀方剂要素效果最佳,表明该方剂要素在调节ApoE-/-动脉粥样硬化模型小鼠血小板聚集率水平、抑制脂质斑块形成起至关重要的作用。

本研究以血小板聚集率和血管内皮粘附分子作为切入点,结合斑块面积及活血散瘀疗效评价,评判当归芍药散及其方剂要素对AS的防治作用,为临床使用当归芍药散及其方剂要素提供重要实验依据。这对于指导临床中医用药有一定的参考价值,其中活血散瘀组(当归-川芎)是如何有效减小斑块面积的信号通路尚不清楚以及当归芍药散中方剂要素的两两组合对AS斑块面积是协同还是抑制作用,这些问题仍值得进一步的研究探索。