禹白芷苯丙氨酸解氨酶基因AdPAL1 的克隆与表达分析

张晓东，刘勇江，沙 漠，赵晶晶，李会平，张喜

（许昌学院食品与药学院，河南 许昌 461000）

【研究意义】禹白芷（Angelica dahuricacv.Yubaizhi）是河南道地药材，为伞形科当归属植物白芷的干燥根。禹白芷富含香豆素类、挥发油类和黄酮类化合物，具有解表散寒，祛风止痛，宣通鼻窍，燥湿止带，消肿排脓等功效，常被用于治疗感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊、牙痛、带下、疮疡肿痛等病症［1］。禹白芷位于禹药之首，被收录于历届《中国药典》［1］。根据《地理标志产品保护规定》，我国自2006 年12月28 日起对禹白芷实施地理标志产品保护。由于其独特的香气和优质的特性，禹白芷被广泛用于中医临床饮片配方、保健品、化妆品和香料等领域［2］。然而，禹白芷生产面临连作障碍和道地产区耕地面积逐年减少的问题。因此，利用合成生物学方法生产禹白芷的主要药效成分香豆素具有重要的前景。【前人研究进展】在植物中，香豆素的生物合成起源于苯丙素途径［3］。苯丙氨酸解氨 酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL，EC：4.3.1.24）是苯丙素生物合成途径的第一个酶（图1），能够催化L-苯丙氨酸中氨的氧化，生成反式肉桂酸，并释放氨气［4］。在植物中，PAL 由其多基因家族编码［5］。如拟南芥有4个PAL基因［6］、石防风属植物（Kitagawia praeruptora）有3个PAL基因［7-8］、不同品种咖啡中发现3～6个PAL基因［9］、生菜有5个PAL基因［10］、马铃薯基因组中发现多达14个PAL基因［11］，在禹白芷转录组中预测有4个PAL基因。目前，PAL基因已从拟南芥［12］、孜然芹［13］、罗勒［5］等许多植物中分离。PAL基因的表达具有组织特异性，并被生物和非生物因素诱导。例如，在前胡中，PpPAL基因主要在根中表达，茎和叶中也有少量表达，且茉莉酸甲酯、紫外线和冷处理均能够上调该基因的表达，而过氧化氢、热处理则下调该基因的表达［7］；抽薹后，叶中PpPAL1基因表达量急剧上升，而叶中PpPAL2基因表达量急剧下降［8］。在咖啡中，叶锈病真菌可诱导PAL基因表达，与易感品种Caturra 相比，抗性品种Híbrido de Timor的诱导率更高［9］。在孜然芹中，CcPAL在芽中表达量最高，其次是种子，根中的表达量最低，且镉、受伤、水杨酸和冷处理均可促进其表达［13］。生产上，PAL基因具有广泛用途。研究发现，PAL基因是鉴别金针菇颜色的关键基因［14］。改造后的拟南芥PAL 可用于光学纯L-苯丙氨酸的大规模生产［12］。喷洒壳聚糖纳米颗粒在水稻中可以提升PAL 酶活性、降低水稻种子中苯丙氨酸的含量，为苯丙酮尿症患者提供低苯丙氨酸的稻米［15］。【本研究切入点】目前，禹白芷的研究主要集中在化学成分鉴定［16］、含量测定［17］以及主要药效成分的药理作用［18］等方面。然而，禹白芷AdPAL1基因尚未有相关报道。为实现在工程菌中高效生产禹白芷中的高价值香豆素成分，必须对香豆素生物合成途径的基因进行克隆和功能解析。【拟解决的关键问题】本研究拟首先测定禹白芷快速生长期和收获期根和叶中主要香豆素成分欧前胡素的含量，并同时测定AdPAL1基因同期的表达情况，探究它们之间的相关性。随后，根据禹白芷转录组中AdPAL1基因序列，设计特异性引物，利用RT-PCR 技术从禹白芷根中扩增AdPAL1基因，并进行序列分析和原核表达，以期为禹白芷AdPAL1基因的功能及其在欧前胡素生物合成中的作用机制解析提供参考。

图1 植物香豆素生物合成途径Fig.1 Coumarin biosynthesis pathway in plants

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为禹州市中药材标准化中心提供的禹白芷（Angelica da huricacv.Yubaizhi）种子。2020 年9 月5 日，在许昌学院道地药材种植基地播种；并于2021 年6 月29 日（快速生长期）和2021 年7 月29 日（收获期）采样。基因克隆所用材料为禹白芷的根，基因组织特异性表达分析所用材料为一年生禹白芷的根（顶端1/5 处）和成熟的大叶片。

1.2 试验方法

1.2.1 欧前胡素含量测定 采用安捷伦1260 高效液相色谱（HPLC）仪，按照《中国药典》［1］的方法测定白芷干燥根和干燥叶中欧前胡素的含量。使用梯度浓度绘制标准品的标准曲线，所有样品均重复3 次。

1.2.2 根总RNA 提取及AdPAL1基因开放阅读框（ORF）克隆 按照张玲等［19］的方法提取禹白芷根总RNA、合成cDNA 和克隆AdPAL1基因ORF，获得重组质粒pMD19-AdPAL1。AdPAL1基因引物为AdPAL1NdeI-F：CATATGCTTGTGAGGATCAACACACT（下划线为NdeI 酶切位点），AdPAL1HindIII-R：AAGCTTAG AAATTGGTAGAGGAGCTCCAT（下划线为HindIII酶切位点），退火温度为61 ℃。

1.2.3AdPAL1基因原核表达载体构建 通过酶切连接的方法［19］构建原核表达载体ProS2-AdPAL1。

1.2.4 AdPAL 蛋白生物信息学分析 按照张玲等［19］的方法对AdPAL1 蛋白进行生物信息学分析。利用ProtComp v9.0 软件预测蛋白的亚细胞定位情况。使用STRING 网站对AdPAL1 蛋白与其他蛋白间的互作进行预测［20］。多序列比对和进化树构建所使用蛋白的GenBank 登录号分别为：绿竹Bambusa oldhamii，BoPAL（AAR24505.1）；水稻Oryza sativaindica group，OsPAL（CAA61198.1）；青稞Hordeum vulgaresubsp.vulgare，HvPAL（CAA89007.1）；小麦Triticum aestivum，TaPAL（CAA68036.1）；小立碗藓Physcomitrella patens，PpaPAL（XP_001760495.1）；银杏Ginkgo biloba，GbiPAL（ABU49842.1）；麻黄Ephedra sinica，EsPAL（BAG74770.1）；欧洲云杉Picea abies，PaPAL（CAK 22402.1）；火炬松Pinus taeda，PtaPAL（AAA84889.1）；罂粟Papaver somniferum，PsPAL（XP_026403210.1）；毛果杨Populus trichocarpa，PtPAL（ACC63889.1）；狭叶油茶Camellia lanceoleosa，ClPAL（KAI8012953.1）；小叶种茶Camellia sinensisvar.sinensis，CsPALd（QIH97409.1）；石防风属植物Kitagawia praeruptora，KpPAL1（UXG20228.1）、KpPAL2（UXG20229.1）；美味猕猴桃Actinidia deliciosa，AdePAL2（QED11031.1）；中华猕猴桃Actinidia chinensisvar.chinensis，AcPAL（PSS23706.1）；紫花前胡Angelica decursiva，AdecPAL（QCY50324.1）；野胡萝卜Daucus carota，DcPAL（BAC56977.1）；欧芹Petroselinum crispum，PcPAL3（P45729.1）；当归Angelica sinensis，AsPAL（AJW77399.1）；金银花Lonicera japonica，LjPAL（AGE10589.1）；灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides，LmPAL（AZR37753.1）；蓝靛忍冬Lonicera caerulea，LcPA（ALU09327.1）；莴苣Lactuca sativa，LsPAL（XP_023767814.1）；雪莲Saussurea involucrata，SiPAL（ALK02780.1）；刺苞菜蓟Cynara cardunculusvar.scolymus，CcPAL（XP_024986252.1）；青蒿Artemisia annua，AaPAL（AKP55356.1）；红凤菜Gynura bicolor，GbPAL（BAJ17655.1）；西洋梨Pyrus communis，PcPAL（AGL81344.1）；芝麻Sesamum indicum，SinPAL（XP_011077338.1）；向日葵Helianthus annuus，HaPAL（KAJ0657456.1）；非洲菊Gerbera jamesonii，GjPAL（QBC35985.1）；苹果Malus domestica，MdPAL1（XP_008387584.2）；紫苏Perilla frutescens，PfPAL（AEZ67457.1）；禹白芷Angelica dahuricacv.Yubaizhi，AdAPL1（WGD08245.1），AdPAL2（WGD08246.1）。

1.2.5AdPAL1基因的原核表达 参照张玲等［19］的方法进行重组质粒ProS2-AdPAL1的原核表达与SDS-PAGE 检测。菌体收集后，使用1×PBS洗涤菌体，使用JY92-IIDN 型超声细胞破碎仪（新芝，宁波）进行细胞破碎。4 ℃、12 000 r/min 离心30 min，分离上清和沉淀。

1.2.6AdPAL1基因的组织特异性表达分析 分别取一年生快速生长期和收获期禹白芷的根和叶，按照张玲等［19］的方法进行AdPAL1基因的组织特异性表达分析。选择AdSAND基因［21］作为内参，引物为qAdSAND-F：5'-TGCTGGAGGAAAGGGGAC-3' 和qAdSAND-R：5'-GCCATTTCCCAGGGACCC-3'，PCR条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s。AdPAL1引物为qAdPAL1-F：5'-AGTGCTAGGGCTGTGCTTG-3' 和qAdPAL1-R：5'-TCCTCTCCAGGCGATGTCA-3'，PCR 条件为：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s。每个反应重复3 次。反应在Archimed X4 荧光定量PCR 仪（鲲鹏基因，北京）上进行扩增，扩增曲线、溶解曲线、标准曲线由定量PCR 仪软件自动生成。使用内参基因校准后，分别计算根和叶中AdPAL1基因相对表达量。采用2-△△Ct的方法进行数据分析。

1.2.7 数据分析 使用Origin 2018C 对欧前胡素含量和AdPAL1基因的表达量进行显著性分析。使用Excel 2019 中的CORREL 函数计算快速生长期与收获期欧前胡素变化量、AdPAL1基因表达变化量的相关系数。

2 结果与分析

2.1 欧前胡素含量测定

分别对禹白芷快速生长期和收获期根和叶中的欧前胡素含量进行测定，结果（图2）表明，两个时期根中的欧前胡素含量均显著高于叶，并且在快速生长期根和叶中的欧前胡素含量均略高于收获期。

图2 不同生长时期根和叶中的欧前胡素含量Fig.2 Content of imperatorin in roots and leaves at different growth stages

2.2 AdPAL1 基因的组织特异性表达分析

取禹白芷快速生长期和收获期的根和叶，通过qRT-PCR 分析AdPAL1基因在不同组织中的表达情况。结果（图3）表明，快速生长期根中AdPAL1基因的表达量显著高于叶，约是叶中表达量的21 倍；收获期根中AdPAL1基因的表达量约为叶中的50.21%。此外，根中AdPAL1基因表达变化量与欧前胡素累积变化量的皮尔逊相关系数为0.46（中度相关），而叶中AdPAL1基因表达变化量与欧前胡素累积变化量的皮尔逊相关系数为0.17（弱相关），综合以上研究结果，初步判断在根中AdPAL1基因参与欧前胡素的生物合成。

图3 不同生长时期根和叶中的AdPAL1 基因相对表达Fig.3 Relative expression of AdPAL1 gene in roots and leaves at different growth stages

2.3 禹白芷AdPAL1 基因序列克隆

以禹白芷幼叶cDNA 为模板，使用特异性引物扩增出约2 000 bp 的片段（图4）。通过TA 克隆获得重组质粒pMD19-AdPAL1，酶切检测结果显示双酶切获得的2 个DNA 片段大小之和等于单酶切片段大小，表明AdPAL1基因已成功插入到pMD19T 载体中。

图4 AdPAL1 基因的PCR 扩增结果Fig.4 PCR amplification result of AdPAL1 gene

2.4 AdPAL1 蛋白生物信息学分析

利用Genetyx 和DNAMAN 软件对AdPAL1基因ORF 序列进行分析，结果表明AdPAL1基因ORF 长1 764 bp，编码557 个氨基酸。本研究中所克隆到的AdPAL1基因与二代转录组拼接获得的AdPAL1核苷酸序列并不完全一致，二者相似性为99.64%。将该序列上传至GenBank 数据库，获得GenBank 登录号为OQ822236。

使用GenBank 数据库中的BLASTp 程序对AdP AL 1蛋白进行比对分析，结果发现禹白芷AdPAL1 与石防风属植物KpPAL2 蛋白序列相似性最高（99.28%），与紫苏（Perilla frutescens）PfPAL 蛋白相似性稍低（88.31%）。利用DNAMAN 将AdPAL1 蛋白序列与从NCBI 中挑选的相似性较高的部分序列进行多序列比对分析，结果表明AdPAL1 蛋白与已知蛋白相似性很高，在第39～54 位氨基酸残基之间含有保守基序“GTITASGDLVPLSYIA” 和Ala-Ser-Gly 催 化三联体，这被预测为典型的苯丙氨酸和组氨酸解氨酶（HAL）特征模式［22-23］（图5）。此外，AdPAL1 蛋白还包含PAL 保守催化活性位点，如GLALVNG（96～102）、NDN（223～225）和HNQDV（327～331）［8,24］（图5）。利用IQTREE2将AdPAL1 蛋白序列与已发表文献中相似性较高的序列进行系统发育分析，结果进化树分为4 个进化枝，分别为单子叶植物、苔藓植物、裸子植物和双子叶植物，其中禹白芷AdPAL1 蛋白与伞形科植物当归、欧芹、野胡萝卜、紫花前胡、石防风属植物的PAL 蛋白聚为同一大进化枝，尤其是与石防风属植物KpPAL2 蛋白处于同一小进化枝（图6），表明二者亲缘关系较近，具有相似或相同的结构与功能。

图5 AdPAL1 蛋白与其他植物PAL 蛋白的多序列比对结果Fig.5 Multiple sequence alignment results of AdPAL1 protein with other plant PAL proteins

图6 AdPAL1 蛋白与其他植物中PAL 蛋白的系统发育分析Fig.6 Phylogenetic analysis of AdPAL1 protein and other plant PAL proteins

使用ExPASy ProtParam tool 对AdPAL1 蛋白进行理化性质分析，结果表明AdPAL1 蛋白单体相对分子质量为61.10 kD，理论等电点（pI）为5.92；带正电氨基酸残基（Arg+Lys）为62，带负电氨基酸残基（Asp+Glu）为54。蛋白不稳定指数为36.77，属于稳定蛋白；脂肪指数为93.68，总平均疏水性（GRAVY）为-0.124，为亲水蛋白。AdPAL1 蛋白含有20 种基本氨基酸，其中亮氨酸含量最高、为11.10%；其次是丙氨酸和谷氨酸，分别为7.90%和7.50%；色氨酸含量最低、为0.4%。

利用SSpro 方法对AdPAL1 蛋白进行二级结构分析，结果发现该蛋白二级结构中α-螺旋（H）占58.53%，无规则卷曲（C）占38.78%，延伸带（E）占2.69%。利用Swiss-Model Workspace 使用自动模式预测AdPAL1 蛋白的三级结构，发现该模型为同源四聚体（图7），是以欧芹苯丙氨酸解氨酶［6f6t.1.A］为模板，在第1～557 位氨基酸处建模，序列相似度为94.23%。使用SMART 软件进行蛋白保守结构域预测，结果表明AdPAL1 蛋白在第1～338 氨基酸位置具有芳香族氨基酸裂解酶结构域。使用InterPro 在线工具对AdPAL1 蛋白进行蛋白家族归类分析，结果表明AdPAL1 蛋白属于芳香族氨基酸裂解酶（IPR001106，1～556）家族、苯丙氨酸解氨酶（IPR005922，1～547）亚家族成员。

图7 AdPAL1 蛋白四聚体的三维结构预测Fig.7 3D Structure prediction of AdPAL1 protein tetramer

使用SignalP 6.0 服务器分析AdPAL1 蛋白，未发现信号肽，表明该蛋白为非分泌型蛋白。利用TMHMM 工具预测AdPAL1 蛋白的跨膜螺旋区，结果表明AdPAL1 蛋白不含跨膜螺旋区域，为非膜蛋白。利用亚细胞定位软件ProtComp 9.0 预测AdPAL1 蛋白，结果显示其定位于细胞质。

蛋白相互作用预测结果表明，AdPAL1 蛋白与C4H、4CL1、4CL2、4CL3、4CL5、HISB6B、AAS、ACOS5（类4CL 酶）、CCoAMT1、AT4G05160等10 个蛋白存在互作，其中PAL、C4H、4CL、CCoAMT 是简单香豆素生物合成的催化酶，AAS参与细胞氨基酸代谢，AT4G05160 参与脂肪酸的激活，HISN6B 为参与组氨酸生物合成的组氨酸磷酸转氨酶（图8）。

图8 AdPAL1 蛋白互作网络预测结果Fig.8 AdPAL1 protein interaction network prediction results

2.5 AdPAL1 基因原核表达载体构建

使用NdeI和HindIII 双酶切质粒ProS2-AdPAL1，可切出目的片段和载体，且两片段之和等于单酶切片段长度（图9），表明AdPAL1基因已成功插入原核表达载体ProS2 中。

图9 质粒ProS2-AdPAL1 酶切检测结果Fig.9 Enzyme digestion detection results of plasmid ProS2-AdPAL1

2.6 AdPAL1 基因原核表达

将重组质粒ProS2-AdPAL1转化大肠杆菌BL21（DE3）后，使用IPTG进行诱导表达。在15 ℃、终浓度为0.5 mmol/L IPTG 下，分别诱导表达0、2、4、6、8 h后，提取细菌总蛋白进行SDS-PAGE分析。结果表明，与对照相比，ProS2-AdPAL1转化菌经IPTG 诱导后，在相对分子质量84 kD（含Protein S 标签蛋白23 kD）左右有1 条蛋白条带，并且随诱导时间增加其蛋白含量逐渐增加，表明重组质粒ProS2-AdPAL1在大肠杆菌BL21（DE3）中成功诱导表达了AdPAL1 蛋白。当温度为15 ℃、诱导时间为6 h 时，蛋白表达量最高（图10）。为检测AdPAL1 融合蛋白的存在形式，对诱导表达8 h 的菌体进行超声破碎，然后使用SDS-PAGE检测，结果表明AdPAL1 蛋白全部以包涵体形式存在（图11）。

图10 15 ℃下不同诱导时间对AdPAL1 蛋白表达的影响Fig.10 Effects of different induction times on AdPAL1 protein expression at 15 ℃

图11 AdPAL1 重组蛋白存在形式的检测Fig.11 Detection of the presence form of AdPAL1 recombinant protein

3 讨论

植物PAL 在介导和协调初级到次级代谢的碳通量方面发挥着关键作用，这对于植物应对不同的环境条件以适应和优化生长至关重要［25］。禹白芷的主要药效成分为香豆素类化合物，通过苯丙素途径合成［3］。在植物中，PAL 是苯丙素途径的第一个限速酶［26］。因此，禹白芷AdPAL基因的表达情况直接或间接影响香豆素的生物合成。本研究中，不同生长时期禹白芷根和叶中欧前胡素变化量与AdPAL1基因表达变化量具有中度相关性，判断AdPAL1基因可能参与欧前胡素的生物合成。因此，对禹白芷AdPAL1基因进行克隆和生物信息学分析，结果表明所克隆的AdPAL1基因ORF 全长1 764 bp，编码557 个氨基酸，pI为5.92，其与番红花CsPAL 蛋白（559 aa，pI 为5.7）类似，但比白花前胡PpPAL1（718 aa，pI 为6.25）和PpPAL2 蛋白（705 aa，pI 为6.16）5′端要短［8］，比孜然CcPAL 蛋白（116 aa，pI 为5.85）要长得多［13］。蛋白保守结构域预测结果显示，AdPAL1蛋白在第1～338 位氨基酸位置具有芳香族氨基酸裂解酶结构域。InterPro 软件则将AdPAL1 蛋白归类为芳香族氨基酸裂解酶（IPR001106，1～556）家族、苯丙氨酸解氨酶（IPR005922，1～547）亚家族成员。事实上，芳香族氨基酸裂解酶家族包含苯丙氨酸解氨酶（PAL，EC4.3.1.24）、组氨酸解氨酶（HAL，EC24.3.1.3）和酪氨酸氨基变位酶（EC5.4.3.6）三类［27-29］。PAL 和HAL 是类裂合酶I 超家族成员，均催化类似的β 消除反应，形成同源四聚体才具有活性，且二者均具有翻译后环化特征及催化作用的Ala-Ser-Gly 三位一体结构［30］。PAL 是植物和真菌中苯丙素组装的关键生物合成催化剂，并参与多种次生代谢产物如黄烷类、呋喃香豆素类植保素及细胞壁成分的生物合成。这些化合物对于植物正常生长和环境胁迫响应至关重要。HAL 催化组氨酸降解的第一步，即从组氨酸中去除氨基团以产生尿刊酸。PAL 和HAL 中的核心结构域约有30%的序列一致性，其中PAL包含从共同折叠处延伸的约160个残基［31］。酪氨酸2,3-氨基突变酶具有氨基突变酶活性，并且在较小程度上具有氨裂解酶活性［32］。这表明AdPAL1 为苯丙氨酸解氨酶。近期研究发现，石防风属植物KpPAL2 能够催化从L-苯丙氨酸到反式肉桂酸的反应［8］。本研究中，AdPAL1 蛋白与KpPAL2 蛋白序列相似性高达78.44%，并与KpPAL2 处于同一进化枝，这进一步表明AdPAL1为苯丙氨酸解氨酶。因此，本研究所克隆基因为PAL基因。

在植物中，蛋白的亚细胞定位对于基因功能的解析至关重要。在本研究中，预测结果显示AdPAL1 蛋白定位于细胞质，这与白花前胡中PpPAL 蛋白定位于细胞质的结果相一致［7］。PAL基因的表达也具有组织和时空特异性，并与活性化合物的生物合成相关联。在前胡中，MeJA、UV 和冷处理诱导的PpPAL基因表达与白花前胡甲素含量呈正相关［7］。在巴戟天中，McPAL3在叶片和成熟果实中表达，McPAL2仅在叶片中表达，McPAL1主要在果实幼龄期表达，但仅有McPAL3的表达模式与东莨菪内酯含量累积规律一致［33］。半夏的药用部位为块茎，PtPAL基因在叶中表达量最高，其次是块茎和根，花中表达量最低［34］。冬凌草的药用部位为茎和叶，IrPAL基因在叶片中表达量最高，茎次之，根中表达量最低［35］。本研究中，禹白芷的药用部位为根，且快速生长期的AdPAL1基因主要在根中表达，收获期在根中的表达量下降约50%，这暗示AdPAL1基因参与禹白芷欧前胡素的生物合成。此外，收获期禹白芷叶片中AdPAL1基因的表达量显著高于快速生长期，这与巴戟天中老叶McPAL3基因的表达量远远高于幼叶和成熟叶的现象一致［33］。这可能是老叶中乙烯含量升高［36］，并诱导AdPAL1和McPAL3基因上调表达的结果［33］。下一步将对AdPAL1 蛋白进行纯化和酶活分析，为进一步阐明禹白芷欧前胡素生物合成途径奠定基础。

4 结论

本研究发现，根中AdPAL1基因表达的变化与欧前胡素含量的变化呈中度相关，初步证明AdPAL1基因参与了欧前胡素的生物合成。成功克隆AdPAL1基因，该基因ORF 长1 764 bp，编码557 个氨基酸，单体相对分子质量为61.10 kD，理论等电点为5.92。AdPAL1 蛋白为亲水稳定蛋白，定位于细胞质，无信号肽、跨膜螺旋区域，其二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成，三级结构呈同源四聚体形式。AdPAL1 与石防风属植物KpPAL2 蛋白亲缘关系最近，且可能与香豆素生物合成途径中的C4H、4CL、CCoAMT等蛋白存在相互作用。构建原核表达载体ProS2-AdPAL1，并在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达出AdPAL1 蛋白，表达形式为包涵体。本研究结果对于揭示AdPAL1基因的功能和欧前胡素生物合成途径具有重要参考价值。