广东地区H9N2 亚型禽流感病毒HA和NA基因生物学特征分析

曾庆航，刘杨，孙敏华，胡鑫宇，谢梓民，张敏霞，袁朝霞，廖明

（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广东 广州 510225；2.广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室，广东 广州 510640）

【研究意义】H9N2 亚型禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）是目前家禽养殖中最常见的病毒之一，极易发生基因突变和基因重组，导致免疫逃逸而造成免疫失败。该病毒感染性强，传播速度快，易感染雏鸡和青年鸡群，主要侵害机体上呼吸道，可引起机体的免疫抑制，引发混合感染或继发感染，导致鸡群生长缓慢、蛋品质和产蛋量下降。由于其致病性低，导致H9N2 亚型AIV 在许多国家未被良好监测和有效控制，现已在全球家禽中流行；其流行广泛，危害持久，难以清除，给养禽业构成严重威胁并造成了巨大经济损失。因此，研究H9N2 亚型AIV 的遗传进化和生物学特征，为我国H9N2 亚型AIV 防控提供参考数据具有重要意义。【前人研究进展】H9N2 亚型AIV 最早于1966 年在美国威斯康星州北部的火鸡上发现，我国则于1992 年在广东省的鸡群中首次发现该病毒，随后该病毒在我国多地出现并蔓延，经历了BJ94-like →F98-like →Y280-like 的演化，当前国内流行毒株均属于h9.4.2.5 分支（Y280-like）［1-3］。自1999 年首次发现人感染H9N2 亚型AIV 以来，截至2022 年3月30 日全球共发现110 例，我国发生97 例（占比88.18%），主要集中在我国南方，而广东省报道最多［4-7］。据多项研究报道，H9N2 已取代H5N6 和H7N9 成为在禽类中流行的优势亚型，且其作为病毒基因库为H3N8、H5N1、H5N6、H7N9、H10N8 等亚型AIV 提供内部基因进行基因重组，被认为可能引起下一次流感大流行［8-15］。【本研究切入点】AIV 属于正黏病毒科甲型流感病毒属，基因组由8 个长度在890～2 341 个核苷酸的单链负义RNA 片段组成，可编码病毒的17 种结构蛋白，其中以HA 和NA 变异最大，是AIV 最主要的保护性抗原，因此HA和NA基因常作为基因变异依据用于AIV 遗传进化和生物学特征分析［16］。【拟解决的关键问题】本研究通过对2022 年广东地区3 株H9N2 亚型AIV的HA和NA基因进行遗传进化和生物学特征分析，为我国H9N2 亚型AIV 的进化分析和防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试毒株 H9N2 亚型AIV 毒株 A/Chicken/Guangdong/JY01/2022、A/Chicken/Guangdong/FS03/2022、A/Chicken/Guangdong/KP03/2022（表1），由广东省农业科学院动物卫生研究所分离鉴定和纯化保存。

表1 毒株信息Table1 Virus strains information

1.1.2 引物 设计合成AIV-12bp 随机引物、HA和NA基因PCR 通用引物（表2），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 引物信息Table2 Primer information

1.1.3 主要试剂 病毒DNA/RNA 提取试剂盒（磁珠法）购自西安天隆科技有限公司，2×Taq Master Mix 和DL2000 DNA Marker 购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，PrimeScript™ RT Master Mix、pMD19-T 载体和DH5α 感受态细胞购自宝生物工程（大连）有限公司，琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒和质粒提取纯化试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1HA和NA基因扩增、克隆及测序 对病毒液进行总RNA 提取，根据PrimeScript ™ RT Master Mix 说明书，使用AIV-12bp 随机引物进行反转录获得cDNA；使用HA和NA基因通用引物进行PCR 扩增，将目的基因纯化回收，与pMD19-T载体连接并转入DH5α 感受态细胞，挑取阳性克隆质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司进行Sanger 测序。

1.2.2HA和NA基因遗传进化及氨基酸关键位点分析 采用SeqMan、Editseq、PhyloSuite 软件对核苷酸序列进行拼接，并进行氨基酸关键位点比对分析；运用Megalign 软件对核苷酸序列进行同源性分析；利用MEGA11 软件采用ML 法绘制HA、NA基因遗传进化树；使用NetNGlyc 1.0 Server软件对氨基酸序列N-糖基化位点进行分析。

2 结果与分析

2.1 HA和NA 基因PCR 扩增和测序结果

3 株H9N2 亚 型AIV的HA和NA基因PCR扩增产物分别在1 683 bp和1 401 bp的位置（图1）。测序结果与预期大小一致，3株病毒的HA基因完整开放阅读框（ORF）各含有 1 683 个核苷酸，NA基因完整ORF 各含有 1 401 个核苷酸（图2）。

图1 HA（A）、NA（B）基因的PCR 产物Fig.1 PCR p roducts of HA (A) and NA (B) genes

图2 3 株H9N2 亚型AIV 的 HA、NA 基因ORF 测序结果Fig.2 ORF sequencing results of HA and NA genes of three H9N2 AIV strains

2.2 HA和NA 基因系统发育树分析结果

基因系统发育树分析结果显示，HA基因属于当前国内流行的h9.4.2.5 分支，与经典株A/Chicken/Guangxi/55/200 的遗传距离较远，已进化成新的亚群，命名为h9.4.2.5c 分支（图3A）；NA基因仍属于1 分支，与早期流行的经典株A/Duck/Hong Kong/Y280/97 遗传距离较远，在近几年形成了一个相对稳定的新的亚分支，命名为1.2分支（图3B）。

图3 3 株H9N2 亚型AIV的HA（A）、NA（B）基因系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of HA (A) and NA (B) genes of three H9N2 AIV strains

2.3 HA和NA 基因核苷酸 序列同源性分析结果

核苷酸序列比对分析结果（表3）显示，3株H9N2 亚型AIV 之间HA基因核苷酸序列同源性为 97.6%～98.3%，与h9.4.2.5 分支经典代表株A/Chicken/Guangxi/55/2005 的同源性最高，介于91.3%～91.7%之间；与h9.4.2.4 分支经典代表株A/Duck/Hong Kong/Y280/97 的同源性最低，介于81.6%～81.9%之间。3 株H9N2 亚型AIV 之间NA基因核苷酸序列同源性为97.2%～98%，与h9.4.2.3分支疫苗株A/Chicken/Guangdong/SS/94 的同源性最高，介于89.4%～89.8%之间；与h9.4.2.5 经典分支代表株A/Chicken/Guangxi/55/2005 同源性最低，介于86.0%～86.8%之间。

表3 HA和NA 基因核苷酸序列同源性Table 3 Homology of nucleotide sequence of HA and NA gene（%）

2.4 HA 氨基酸序列关键位点分析结果

3 株H9N2 亚型AIV的HA基因序列完整的ORF 均由1 683 个核苷酸组成，编码560 个氨基酸；HA 裂解位点均为PSRSSR ↓GLF，符合低致病性特征；受体结合位点均发生了I155T、H183N、A190T/V、T212I、Q226L、Q227M 突变；潜在糖基化位点均只有7 个，218 位由NRT 突变为NRI，变成非糖基化位点，313 位由NCP 突变为NCS，新增糖基化位点（表4）。

表4 HA 糖基化位点和受体结合位点分析Table 4 Analysis of HA glycosylation sites and receptor binding sites

2.5 NA 氨基酸序列关键位点分析结果

3 株H9N2 亚 型AIV的NA基因序列完整的ORF 均由1 401 个核苷酸组成，共编码466个氨基酸；与参考株 A/Chicken/Beijing/1/94、A/Chicken/Guangdong/SS/94、A/Duck/Hong Kong/Y280/97 相比，在茎部均缺失187～195 位9 个核苷酸（ACAGAGATA），导致NA 蛋白缺失63～65位3 个氨基酸（TEI），这与A/Duck/Hong Kong/Y280/97 株为代表的国内流行毒株一致。1.2 分支NA 蛋白的红细胞结合位点（Hemadsorbing site，HB）366～373 位产生K/E/S368N、D369N 突变 ；与NA 蛋白活性、抗流感药物奥司他韦和扎那米韦耐药性相关的E119、D151、R152、R224、E276、R292、R371 位点均未发生突变（表5）。

表5 NA 蛋白HB 结合位点、活性位点和耐药性位点分析Table 5 Analysis of NA protein HB binding sites,active sites and drug resistance sites

3 讨论

禽流感病毒属于RNA 病毒，在免疫压力和外界因素影响下易发生基因突变和基因重组，进化出新的基因型。我国自1992 年首次报道H9N2亚型AIV 已有30 年的流行历史，期间经历了BJ94-like →F98-like → Y280-like 的演化，1997年报道A/Duck/Hong Kong/Y280/97 毒株后，以Y280-like 为代表的毒株成为我国流行的优势毒株，均属于h9.4.2.5 分支［17-18］。我国于1998 年开始在鸡群中使用灭活疫苗来控制该病毒引起的疾病，在家禽疫苗接种计划后，H9N2 亚型AIV的演变速度加快［19-21］。AIVNA基因的0 分支以A/Chicken/Hong Kong/G9/97 株为代表，主要在1997—2011 年流行；1 分支则在1994—2006 年流 行，以A/Chicken/Beijing/1/94 和A/Duck/Hong Kong/Y280/97 株为代表；2007—2013 年开始演变出稳定的1.1 和1.2 亚分支并流行至今［22］。本研究3 株H9N2 亚型AIV 的基因遗传进化分析结果显示，HA、NA基因与早期的经典株A/Chicken/Beijing/1/94、A/Chicken/Guangxi/55/2005 和疫苗株A/Chicken/Shanghai/F/98、A/Chicken/Guangdong/SS/94 等的遗传距离较远，核苷酸同源性分别仅为81.6%～91.7%和88.2%～91.2%，已经进化成新的亚群［6-9］。因此，持续跟踪、系统分析，及时掌握流行变异情况，对H9N2 亚型AIV 的防控具有重要意义。

流感病毒侵染细胞的先决条件是HA 裂解为HA1 和HA2，HA2 暴露出疏水端，HA 蛋白发生融膜［23］。LPAIV HA 裂解位点一般为R-S-S-R结构，只含1 个或2 个连续碱性氨基酸，只有精氨酸特异蛋白酶能识别并裂解这种结构，因此一般只引起局部感染。本研究3 株H9N2 亚型AIV HA 蛋白酶解位点序列为PSRSSR ↓GLF，符合低致病性特征。与A/Chicken/Guangxi/55/2005 经典株等相比，3 个分离株HA 蛋白裂解位点的第334位均由A 变为S，而研究表明该突变会增强病毒对家禽的致病性［24］。

流感病毒的适应性突变主要发生于病毒表面膜蛋白，包括HA 蛋白受体位点的改变、糖基化修饰位点的分布和NA 蛋白茎部的缺失［25］。有研究报道，HA 蛋白受体结合位点155、183、190、212、226、227 位与人源唾液酸受体结合的亲和力有关，I155T、H183N、A190T/V、T212I、Q226L、Q227M 突变会增强与人源唾液酸受体结合的亲和力，其中190V 具有高度亲和力，其次是190T［26-28］。本研究中，3个分离株HA 蛋白受体结合位点分析显示，均发生I155T、H183N、A190T/V、T212I、Q226L、Q227M 突变，提示表现出人源唾液酸受体结合特性。另有研究表明，HA 蛋白218N 突变为非糖基化位点，同时313N新增为糖基化位点，会增强病毒与受体的结合能力，阻止同源抗血清对病毒的中和作用，以及增强病毒对细胞的感染能力和在细胞中的复制能力［29-30］。本研究3 个分离株HA 蛋白糖基化位点分析显示，218 由NRT 突变为NRI 成为非糖基化位点，同时313 位由NCP 突变为NCS，新增为糖基化位点，与前期研究相符，提示该突变同时提高了该3 株病毒的致病性及改变了其抗原性。

NA 蛋白头部有酶活性中心和抗原位点，茎部与蛋白锚定有关［23］，茎部缺失是流感病毒毒力增强的标志［31］。本研究3 株H9N2 亚型AIV的NA基因序列分析显示，与参考株A/Chicken/Beijing/1/94、A/Chicken/Guangdong/SS/94、A/Duck/Hong Kong/Y280/97 相比，分离株的茎部均缺失187～195 位9 个核苷酸（ACAGAGATA），导致NA 蛋白缺失63～65 位3 个氨基酸（TEI），这与A/Duck/Hong Kong/Y280/97 株为代表的国内流行毒株一致。茎部缺失使病毒更易脱离细胞，增强毒力、扩大宿主范围［32］。流感病毒NA 蛋白上E119A/D/G/V、D151E、R152K、R224K、E276D、R292K、R371K 位点突变会改变蛋白活性和增强对抗流感病毒药物奥司他韦、扎那米韦的耐药性［33-34］。本研究3 株H9N2 亚型AIV 的以上位点均未发生此突变。研究报道，NA 蛋白的红细胞结合位点366～373、399～404 和431～433 分别形成3 个环状结构，唾液酸和氨基酸直接结合在环状结构中［35］。本研究观察到HB 结合位点产生K/E/S368N、D369N 的变化，该突变是否会影响唾液酸和氨基酸结合有待进一步探究。

4 结论

2022 年从广东部分地区分离的3 株H9N2 亚型AIV的HA和NA基因分别属于h9.4.2.5c 和1.2 分支，与以A/Chicken/Beijing/1/94 为代表的经典株和A/Chicken/Guangdong/SS/94 等疫苗株的遗传距离较远，核苷酸序列同源性分别仅为81.6%～91.7%和88.2%～91.2%，已经进化成新的亚群；HA 氨基酸序列均发生I155T、H183N、A190T/V、T212I、Q226L、Q227M 突变，218N 去糖基化的同时313N 糖基化，以及NA 氨基酸序列63～65 位（TEI）缺失，表明目前广东地区流行的H9N2 亚型AIV 可能增强了对哺乳动物的适应性，且其抗原性发生改变；同时，NA 氨基酸序列E119、D151、R152、R224、E276、R292、R371 均未发生突变，表明其尚未获得对奥司他韦和扎那米韦等抗流感病毒药物的耐药性。本研究结果表 明3 株H9N2 亚型AIV 的HA 和NA 部 分关键氨基酸序列已发生不同 程度变异，建议持续对H9N2 亚型AIV 的流行情况进行监测。本研究结果明确了广东省H9N2 亚型AIV 的感染现状及流行毒株的分子流行病学特点、遗传演化情况，可为广东地区今后更有效地预防控制H9N2 亚型AIV 感染及疫苗选择提供参考。