副猪格拉菌血清2 型毒力及耐药性分析

王治方，徐引弟，朱文豪，焦文强，张青娴，李海利，许 峰，王克领

（河南省农业科学院畜牧兽医研究所/河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南 郑州 450002）

【研究意义】副猪格拉菌（Glaesserella parasuis，GPS），原名副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS），是一种革兰氏阴性、长短不一的多形态细小杆菌，属于巴氏杆菌科巴氏杆菌属，是引起猪革拉泽氏病的病原体［1-2］。GPS 在全世界范围内广泛存在，可长期定殖于健康猪的上呼吸道，一般情况下不引起猪只发病，但当断奶、转群等应激因素导致机体抵抗力降低时，可作为原发病原或继发病原感染任何年龄、品种的猪，临床发病率一般为10%～15%，严重时死亡率可达50%以上。发病猪群主要表现为精神沉郁、食欲不振、被毛粗乱、四肢末端发绀、跛行、呼吸困难、颤抖、共济失调等；典型病例的剖检变化主要在腹膜、心包膜、胸膜，或关节面出现浆液-纤维素性或纤维素性化脓性炎症，胸腔、腹腔和心包积液增多，严重时可形成“绒毛心”，已成为当前养猪场最常见的细菌性病原之一［3-5］。【前人研究进展】GPS 血清型较多，不同国家或地区的流行菌株血清型不同，菌株致病力和临床表现也不尽相同。菌株毒力与血清型有较大关联，普遍认为血清1、5、10、12、13、14 型为高毒力菌株，血清2、4、15 为中等毒力菌株；血清3、6、7、8、9、11 型为无毒力菌株［6-7］。但近年来也有研究表明，GPS 临床菌株毒力与血清型并不完全相关，同一血清型不同菌株的毒力不同甚至存在明显差异。不同地区GPS 临床菌株耐药表型不同，同一地区菌株耐药性也呈现动态变化，大都表现出耐药增强趋势，导致GPS临床防控更加复杂［8-9］。【本研究切入点】目前有关GPS 血清2 型的报道较少，在河南地区的报道更少，而本实验室近年来不时从临床病例中分离到GPS 血清2 型，表明血清2型的危害越来越严重。【拟解决的关键问题】本试验对河南省焦作某规模化猪场的疑似GPS 病例进行细菌病原分离培养、纯化，获得1 株可疑病原菌，经形态观察、PCR 鉴定、分型，证实该菌株为猪GPS 血清2 型；同时对该分离菌株的致病性、耐药性、毒力基因和耐药基因携带等部分生物学特性进行研究，旨在为GPS 的临床防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料 病料来源于2022 年7 月河南省焦作某规模化猪场保育猪群临床表现有发热、消瘦、被毛粗乱、喘气、部分猪关节肿大、跛行等症状的疑似病例，剖检症状典型的病猪，采集肺脏、肝脏、气管、心血和关节液等病料。

1.1.2 主要试剂 胰蛋白大豆琼脂（TSA）、胰蛋白大豆肉汤（TSB），购自美国BD Difco 公司；细菌总DNA 提取试剂盒、新生牛血清，购自生工生物工程(上海) 股份有限公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（辅酶Ⅰ，NAD），购自Hoffmann-La Roche 有限责任公司；革兰氏染液试剂盒，购自珠海贝索生物技术有限公司；抗生素药敏纸片，购自杭州滨和微生物试剂有限公司；DL2000 DNA Marker、Premix TaqTMMix 等PCR 试剂，均购自宝生物工程（大连）有限公司；相关引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3 试验动物 10 只体质量250 g 左右的健康豚鼠，购自郑州大学实验动物中心。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌分离、纯化 将无菌采集的发病猪气管、肺脏、心血等病料，分别接种于TSA平板（含5%新生牛血清、0.001% NAD）上，37 ℃培养24～36 h；挑选无色透明针尖状可疑菌落于TSA 平板上划线培养纯化，37 ℃培养24～36 h；挑取单个菌落涂片，革兰氏染色，镜检，通过扫描电子显微镜观察形态；分离菌于10 mL TSB（含5%新生牛血清、0.001% NAD）液体培养基中培养过夜，6 000 r/min离心5 min，PBS 洗脱3 次，用1.5 mL 2.5%戊二醛4 ℃固定4 h 以上，送武汉赛维尔生物科技有限公司进行电镜观察。

1.2.2 菌株鉴定和分型 参照文献［10-12］设计扩 增GPS 16S rRNA 基因和GPS 血清2型wzx基因的特异性引物（表1）。挑取分离菌株于37 ℃培养30 h 的培养物，按照DNA 提取试剂盒说明书提取菌株DNA，用16S rRNA 基因特异性引物和wzx基因引物对分离株DNA 进行PCR 扩增鉴定和分型。PCR 扩增体系25 μL：2×Premix TaqTMMix13 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 8 μL，模板DNA 2 μL。PCR 扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性1 min、退火（退火温度见表1）1 min、72 ℃延伸30 s，共35 个循环；最后72 ℃延伸5 min。取5 μL PCR 扩增产物，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统下观察结果。回收PCR阳性产物送至北京擎科生物科技有限公司测序。

表1 菌株鉴定及分型的引物信息Table 1 Primers information of strain identification and typing

1.2.3 毒力基因检测 参照文献［13-14］设计扩增GPS 部分毒力基因的引物（表2），以分离菌株DNA 为模板进行PCR 扩增，检测分离菌株毒力基因携带情况，PCR 扩增体系和扩增条件参照1.2.2。

表2 毒力基因检测的引物信息Table 2 Primers information of virulence genes detecting

1.2.4 致病性试验 将实验豚鼠随机分为试验组和对照组，每组5 只。将分离菌株接种于TSB 液体培养基中，37 ℃振荡培养18 h 后测定菌体浓度，连续10 倍稀释，选取合适滴度涂布TSA 固体平板，每个滴度3 个平板，每个平板100 μL，37 ℃培养36 h 后活菌计数，计算原液菌体浓度，调整菌体浓度至1×109CFU/mL 备用。试验组豚鼠腹腔注射菌液1 mL/只；对照组豚鼠腹腔注射生理盐水1 mL/只。观察记录每组发病情况，连续观察5 d，对发病死亡豚鼠进行病理解剖、细菌分离鉴定。

1.2.5 药敏试验 采用琼脂扩散法（K-B 法）［15］，将分离菌株接种于TSA 培养基平板，37 ℃培养30 h 后挑取菌落，用灭菌PBS 液调整成浓度为0.5麦氏单位菌悬液，用灭菌棉拭子将菌悬液均匀涂于TSA 平板表面，挑取临床上常用的抗生素药敏片均匀贴于涂有菌液的平板上，37 ℃培养36 h 后测量、记录药敏片抑菌圈直径，结果判断方法参照药敏片说明书。

1.2.6 耐药基因检测 参照文献［16-17］设计引物（表3），扩增β 内酰胺类（blaTEM、blaOXA-1、blaCTX-M-2、blaSHV、blaIMP-1、blaDHA-1）、氨基糖甙类〔aadA1、aadA2、strA、strB、aadB、aacC2、aac(3)-IV、aphA1〕、四环素类〔tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(D)、tet(G)〕、喹诺酮类（gyrA、parC）和磺胺类（sul1、sul2、sul3）的耐药基因。以分离菌株DNA 为模板进行PCR扩增，检测分离菌株携带耐药基因情况，PCR 扩增体系和扩增条件参照1.2.2。

表3 耐药基因检测的引物信息Table3 Primers information of drug-resistant genes detecting

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养纯化结果

通过细菌分离培养、纯化，在猪肺脏组织样品中分离获得1 株疑似副猪格拉菌。该株细菌生长较缓慢，培养30 h 后的菌落针尖大小，形态明显，呈圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，半透明、略带蓝色荧光；接种于不含NAD 的TSA 平板，37 ℃培养均不能生长。挑取单个菌落涂片，革兰氏染色镜检，该菌株为革兰氏阴性球杆状、短杆状，有少量长丝状等多形态菌体（图1A）；扫描电镜下，菌体表面粗糙，呈短绳状（图1B）。

图1 副猪格拉菌形态Fig.1 Morphology of Glaesserella parasuis

2.2 菌株鉴定和血清型检测结果

通过PCR 扩增鉴定，分离菌株扩增出大小分别为1 090、295 bp 的产物带（图2），条带和GPS、血清2 型目的条带大小一致。PCR 扩增产物的测序结果利用BLAST 软件进行同源性比较发现，该菌株与GPS 2 型CL120103 菌株（CP020085.1）的同源性为100%，证明分离的菌株为副猪格拉菌，血清型为2 型，暂命名为HN1553。

图2 菌株血清型PCR 鉴定结果Fig.2 Identification and typing of strains by PCR

2.3 毒力基因测定结果

PCR 扩增检测HN1553 菌株的毒力基因，结果（图3）显示，vta1、vta2、vta3、wza、ompP2、nanH、cdtA、cdtB、cdtC、espP2 毒力基因为阳性。

图3 副猪格拉菌毒力基因PCR 检测结果Fig.3 PCR results of virulence genes of Glaesserella parasuis

2.4 致病性试验结果

注射菌液3 h 后，试验组的5 只豚鼠先后出现食欲减退、被毛蓬乱、蜷缩扎堆、颤抖等症状；攻毒18～36 h，豚鼠先后死亡4 只。对死亡豚鼠剖检，发现胸腔、腹腔少量积液，腹腔粘膜有新鲜出血斑点（图4A），肝脏、脾脏有少量纤维性渗出物附着（图4B）。用腹水、心血、肝脏、脾脏触片，革兰氏染色镜检均发现有革兰氏阴性细小杆菌（图5）。无菌采集死亡豚鼠的心血、肝脏、脾脏、腹水、脑分别接种TSA 平板，37 ℃培养30 h 后，培养基平板均长出均一的针尖大小菌落，经鉴定均为GPS 血清2 型。试验组未死亡的发病豚鼠攻毒72 h 后，被毛粗乱、扎堆等症状减轻，食欲好转；攻毒5 d 后，症状消失，剖检豚鼠发现腹腔粘膜有少量陈旧性出血，肝脏、脾脏、腹腔有少量纤维素性渗出物，脾脏肿大；采集心血、肝脏、脾脏分别接种TSA 平板，37 ℃培养48 h 均未见细菌生长。试验期间，对照组豚鼠生长状态良好，未出现任何临床症状。

图4 死亡豚鼠剖检症状Fig.4 Necropsy symptoms of dead cavy

图5 肝脏的副猪格拉菌形态Fig.5 Morphology of Glaesserella parasuis in liver

2.5 药敏试验结果

药敏试验结果（表4）显示，菌株HN1553对头孢噻呋、头孢他啶、阿莫西林、氨苄西林、左氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星敏感；对新霉素、强力霉素、诺氟沙星的敏感性处于敏感和耐药之间；对青霉素G、卡那霉素、阿米卡星、链霉素、四环素、土霉素、复方新诺明表现耐药。

表4 药敏试验结果Table 4 Drug sensitivity test results

2.6 耐药基因检测结果

PCR 扩增检测HN1553 菌株的耐药基因，结果（图6）显示，aadA1、strA、strB、aphA1、tet（B）、sul2 基因扩增出现目的条带，与预期条带大小一致，证明HN1553 菌株携带氨基糖苷类耐药基因aadA1、strA、strB、aphA1，四环素类耐药基因tet（B）和磺胺类耐药基因sul2。

图6 副猪格拉菌耐药基因PCR 检测结果Fig.6 PCR results of drug-resistant genes of Glaesserella parasuis

3 讨论

副猪格拉菌是当前养猪业的主要细菌性病原之一，可长期定植于健康猪的上呼吸道，一旦机体抗体下降，就可突破机体防御体系，大量繁殖侵入机体不同脏器，引起局部病变或全身症状，给养猪生产造成不同程度的危害。本研究在河南焦作某猪场的疑似副猪格拉菌病例中，通过细菌分离、纯化、形态观察、PCR 鉴定等技术手段，获得1 株副猪格拉菌血清2 型菌株HN1553。

细菌感染机体发病是细菌所有毒力基因共同参与的复杂动态过程，包括细菌粘附、侵入宿主、逃避防御、体内繁殖、组织损伤等［18］。副猪格拉菌毒力因子多，致病机理复杂，对HN1553 菌株扩增检测14 个常见毒力基因，其中10 个毒力基因为阳性，说明该菌株携带有较多的毒力基因，多个毒力基因的协同作用使该菌株表现出较强的致病性。本研究利用豚鼠试验分析了菌株HN1553 的毒力强弱，1×109CFU/mL 浓度菌悬液能使豚鼠100%发病，80%死亡，与贺云霞等［8］的试验结果一致。试验过程中，发病豚鼠均表现明显的临床症状，死亡豚鼠有较明显脏器病变，脏器触片染色能发现细菌，且能从肝脏、脾脏、脑等器官中分离出感染菌株，表明HN1553 菌株对豚鼠有较强的致病性，且能够突破豚鼠的血脑屏障引起脑部感染。

疫苗免疫和抗生素使用是防控副猪格拉菌病的有效途径，但由于副猪格拉菌血清型之间交叉保护差，流行菌株和疫苗菌株血清型不一致，导致疫苗临床防疫效果不佳；同时养殖过程中长期不规范使用抗生素，导致细菌耐药性越来越严重，使得药物抗菌效果越来越差［19］。本研究利用纸片法筛选了菌株HN1553 的敏感药物，发现该菌株对头孢噻呋、头孢他啶、头孢氨苄、阿莫西林头孢类药物敏感，与先前大部分研究结果相同；对左氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星喹诺酮类药物敏感，与王治方等［20］、万世平等［21］报道结果相同，与王同兆等［22］试验结果不同。该菌株对青霉素G、阿米卡星、卡那霉素、链霉素、土霉素、四环素耐药；对复方新诺明完全耐药，与朱孟玲等［23］、史开志等［24］的研究结果一致。细菌耐药表型与其携带的耐药基因有一定关联性，利用PCR 扩增技术对菌株HN1553 进行耐药基因检测，发现该菌株携带有氨基糖苷类耐药基因aadA1、strA、strB、aphA1，四环素类耐药基因tet（B）和磺胺类耐药基因sul2，菌株耐药表型和耐药基因携带基本吻合。规模化猪场发生副猪格拉菌感染病时，应及时分离细菌，筛选敏感药物，是提高治疗效果和降低细菌耐药性的关键。此外，对细菌进行分型鉴定，有针对性地选择血清型相同的疫苗进行免疫接种，是防控该病的首选策略。

4 结论

本试验对河南某猪场临床疑似副猪格拉菌病例猪只进行病原菌分离鉴定、敏感药物筛选及临床药物治疗预防效果分析，证实该猪场保育仔猪的临床症状是由副猪格拉菌血清2 型菌株引起的。对该分离菌株HN1553 的部分生物学特性进行研究，结果表明该菌株毒力较强，携带多个毒力基因和耐药基因，对头孢类药物和喹诺酮类药物敏感，对氨基糖苷类、四环素类和磺胺类药物耐药，表现出严重的多重耐药现象。本研究为副猪格拉菌血清2 型流行病学、致病机制研究提供参考，为副猪格拉菌病的临床综合防控提供依据。