局部涂抹及口服胶原蛋白肽在皮肤年轻化中的研究进展

于潇宇，琚婧仪，李相懿，张姝，李嘉伦

（1.华中科技大学附属武汉协和医院，湖北，武汉，430000 2.武汉皮可力医疗美容诊所，湖北，武汉，430000）

作为人体最大的器官，皮肤是由表皮、真皮层、皮下层三部分构成的。皮肤内源性老化和外源性老化共同决定皮肤的老化进程，这一过程是长期的、高度异质性的。内源性老化是由时间进程决定的，难以避免。其主要由人体自身机制调控，特征是皮肤变薄和细纹产生[1]。内源性老化也是一种氧化过程，这与年龄相关性的皮肤抗氧化能力下降和活性氧（ROS）生成增多有关[2]。外源性老化主要取决于暴露于环境因素的强度和持续时间以及皮肤类型，例如空气污染、吸烟、营养不良和紫外线（UV）光等。随着单细胞测序技术的发展，皮肤老化的分子机制愈发明确，与生长发育有关的转录因子下调是皮肤衰老的重要特征[3]。除了细胞内的变化，细胞外基质（ECM）在内源性和外源性的老化皮肤中也表现出结构和功能的变化，其中胶原蛋白的含量显著减少[4]。

构成皮肤组织的蛋白质成分主要是胶原蛋白[5]。CP是一种线性或环状聚合物（相对分子质量＜3000），主要由水解胶原蛋白组成。CP具有多种生理功能，包括改善皮肤衰老、防止骨质疏松和预防Ⅱ型糖尿病等方面的功能[6]。本文主要关注CP改善皮肤衰老的功能。许多关于CP的体外实验、动物实验和细胞实验结果都已表明，CP在延缓皮肤自然衰老和抑制紫外线引起的光损伤方面具有良好效果[7]。此外，许多临床试验表明，CP能够有效改善人体皮肤弹性、减少皱纹[8]。不同于现存的相关综述，本文主要介绍局部涂抹CP的抗氧化、抗糖化、抗炎作用，并与口服CP的作用相比对。二者作用机制不同，但可以起到协同改善皮肤老化作用。

1 CP 概述

CP有广泛的物质来源，包括猪，牛，水产（主要是鱼类），羊，家禽[9-11]等。我国海洋资源丰富，值得更广泛关注的是水产动物源CP。胶原蛋白是以Gly-X-Y重复序列为特征的三螺旋结构（见图1），由约20种氨基酸组成。CP是胶原蛋白水解后形成的一种介于蛋白质和氨基酸之间的分子质量混合物，通常是几百到几千的分子量[12]。CP中含有羟基脯氨酸和羟基赖氨酸，对多肽的连接和胶原的稳定具有重要作用[6]。CP主要有以下三种获取方式：从天然生物体中提取，化学合成与重组DNA技术，水解体外胶原蛋白[13]。目前，主流的CP制备方法是体外胶原蛋白水解法，即将分子量较大的胶原蛋白水解为分子量较小的多肽。水解体外胶原蛋白法步骤主要有：原料预处理，胶原蛋白提取，胶原水解[14]。

图1 胶原纤维组成和结构

2 局部涂抹应用

2.1 皮肤抗氧化作用

皮肤内源性老化存在氧化应激。这与线粒体渗漏、炎症等增加活性氧（ROS）的产生，以及年龄相关的细胞修复能力下降有关[15]。UVB诱导的光老化与ROS的生成增多密切相关。皮肤老化过程中增多的ROS激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，诱导激活蛋白-1（AP-1）和核因子-Kb（NF-κB），抑制基质金属蛋白酶（MMP）的表达，促进皮肤胶原蛋白的降解；抑制转化生长因子-β（TGF-β）信号通路，抑制皮肤胶原蛋白的合成（见图2）[16-19]。此外，UV照射引起的小鼠氧化应激指标发生异常改变，如降低超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的水平，增加脂质过氧化物（LPO）和丙二醛（MDA）的水平，并触发8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的形成[20]。CP是一种常见的抗氧化剂。这种低分子量蛋白质因其优良的生物相容性、易降解性和较弱的抗原性而被广泛应用。CP通过清除自由基、中断脂质过氧化的自由基链来发挥抗氧化作用[21]。其抗氧化机制尚未完全阐明。据报道，CP的抗氧化效力与CP中的疏水性氨基酸有关[22]。这可能是CP的抗氧化活性位点与自由基结合的空间位阻不同造成的[23]。

图2 皮肤老化的分子机制

Bang等[19]人利用水解牡蛎蛋白制备的CP局部涂抹在UVB照射的无毛小鼠的皮肤上。实验组小鼠的皱纹长度、深度和表皮厚度得到明显改善，体内因UVB照射而降低的抗氧化酶活性得到恢复并调节了促炎细胞因子的表达。Qin等[24]将大马哈鱼鱼皮来源的CP局部涂抹在UVB照射后的大鼠无毛背部皮肤，可增加皮肤抗氧化酶（GSH和SOD）含量，这有效对抗衰老。其中平均分子量为1194.00道尔顿的CP效果最好。鲢鱼骨来源的CP具有减少ROS生成的能力，并使脂质过氧化自由基链中断，呈剂量依赖性的作用[25]。体外实验显示，它对纤维细胞和角质细胞有较好的光线保护的效果。值得注意的是，经过鲢鱼骨CP处理的炎性巨噬细胞释放炎性细胞因子减少，尤其是肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。但CP的抗氧化作用的具体机理还有待明确，这可能与它降低ROS生成，中断过氧化自由基链有关，也可能与它增加抗氧化酶含量有关。

2.2 皮肤抗糖化作用

糖化被视为肌肤加速衰老的关键因素，特别是暴露于紫外线中的皮肤。蛋白、脂质、核酸等大分子与葡萄糖或其他还原单糖反应生成晚期糖基化终末产物（AGEs）。AGES与皮肤的衰老有着密不可分的联系。AGEs直接或间接结合各种细胞表面的AGE特异性受体（RAGE），激活NF-κB和MAPK信号通路，增加MMP的产生[26]，并诱导细胞内ROS[27]和炎性细胞因子的产生[28]。UV通过促进生成AGEs，可使皮肤的糖化程度加剧，释放出大量的活性氧自由基，从而产生氧化应激状态[29]。第二，胶原蛋白由于更新速度慢，更容易发生糖化。AGES在皮肤老化的过程中修饰胶原蛋白，会影响胶原蛋白纤维结构力学功能的完整性，和ECM对MMP介导组织的重塑的敏感性[30]。

局部涂抹CP通过抑制AGEs的积累来对抗皮肤的糖基化进程。据报道，Lee等[31]在一项由22名亚洲女性参与、为期4周的前瞻性单臂研究中发现，局部CP应用后，第4周观察到皮肤皱纹、弹性和密度明显改善，皮肤AGEs积累减少，无不良影响。体外研究表明，成人真皮纤维细胞受紫外线照射，经CP处理后，两种主要的AGEs生物标志物戊糖苷和甲基乙二醛的含量明显减少[31]。抑制AGEs的机理主要包括3个方面，一是抑制其生成；二是断裂交联结构；三是阻断其与受体结合，其中最有效的是抑制AGEs生成，从源头上解决问题。CP抗糖化的机理仍有待进一步阐明。尽管已经生成的AGEs很难被清除，但是通过局部涂抹应用CP，能有效抑制AGEs积累，从而实现皮肤的抗老化。

2.2 抗炎作用

皮肤的内在老化涉及慢性低度炎症。老化皮肤中的衰老细胞对皮肤慢性炎症的驱动有着举足轻重的作用。由于它们的分泌谱与年轻的细胞相比发生了改变，因此被称为衰老相关的分泌表型（SASP）。其分泌谱主要变化有促炎性细胞因子、趋化因子、蛋白酶和生长因子等[32]。有可靠的证据显示，促炎型衰老细胞在许多组织中随着衰老而增强慢性低级别炎症。这种状态叫作炎症性衰老（Inflammaging）[33]。

皮肤中SASP的发展是包括免疫细胞在内的细胞成分之间相互作用的结果。老化的皮肤中，朗格汉斯细胞（LCs）的数量下降，迁移能力也较差[34]。CD4+Foxp3+调节性T细胞的抑制干扰皮肤的免疫监视能力[35]。皮肤驻留的巨噬细胞也表现出向促炎症表型的转变，这促进了进一步的组织炎症[36]。这些免疫细胞是否参与衰老细胞的持续存在尚未明确。

Salminen等[37]认为由紫外线辐射或其他一些损伤引起的持续炎症状态会刺激免疫抑制并促进过早衰老。UVR照射会造成皮肤DNA和ECM的损伤，产生ROS，促进氧化应激，引起炎症反应。炎症刺激皮肤免疫抑制细胞增殖，从而拮抗炎症，但是这又会引发皮肤的免疫抑制状态。免疫抑制细胞分泌抗炎细胞因子（IL-10和TGF-β）,减少真皮脂肪组织[38]，促进细胞衰老并扰乱ECM的结构。皮肤的免疫抑制状态会对发炎组织中的免疫细胞和非免疫细胞产生有害影响[39]。UVR-炎症-免疫抑制通路的激活增加了衰老细胞在受影响组织中的积累，衰老细胞表达SASP，推动皮肤的病理改变[40]。

体外研究实验表明，遮目鱼鳞片中分离的胶原肽不仅具有抗氧化和DNA保护活性，还通过降低脂氧合酶活性、一氧化氮（NO·）自由基等作用而表现出抗炎作用[41]。Peng等[42]局部应用水解牡蛎蛋白来源的CP在皮肤上，通过多种机制显著减轻了慢性UVB照射引起的皮肤胶原蛋白的流失。抗氧化方面，促进了抗氧化酶（SOD和GPH-Px）的活性，同时降低了皮肤中的丙二醛（MDA）水平。抗炎方面，抑制了炎症细胞因子（IL-6、TNF-α）和炎症相关蛋白（iNOS、COX-2）的表达。抗胶原蛋白降解方面，CP抑制金属蛋白酶1（MMP1）的表达。

3 口服CP 改善皮肤水合作用

在社交平台上，口服CP被宣传可以通过增加真皮胶原蛋白、透明质酸和皮肤的水含量来逆转皮肤老化的临床症状。近几年来，消费者对于口服CP的热情逐年上涨[43]。口服胶CP具有改善皮肤水合作用已被多项动物实验、临床试验证实有效。Kang等[44]研究显示，无毛小鼠口服CP后，皮肤皱纹得到改善。同时，改善水合作用，合成透明质酸的透明质酸合成酶表达上调；抑制水合作用，分解透明质酸的透明质酸酶表达下调。口服低分子量CP可以作为一种保健功能食品成分来改善人体皮肤的水合作用、弹性和皱纹。一项随机、三盲、安慰剂对照研究表明，口服CP12周后，实验组皮肤整体水合度、皮肤弹性较安慰剂组有明显改善[45]。口服CP不仅可以美容养颜，还可以增强老年人皮肤机械性能。另一项临床研究显示，39名65岁或以上住院患者中，每天口服1次含有CP的营养补充剂（10.0g）的患者，比对照组角质层水化度和皮肤弹性改善明显，这样可以帮助减少老年人皮肤的脆弱性[46]。Kim等[47]进行了随机、双盲、安慰剂的对照试验，给予每日1000mg低分子量鲇鱼皮CP的女性比安慰剂组女性皮肤水化值更高，皮肤弹性更好，皱纹更少。口服鲢鱼皮CP显著增加皮肤HYP、透明质酸、水分含量，提高血清及皮肤抗氧化酶SOD及CAT的活性[48]。一项针对34名40-65岁健康女性进行的为期12周的临床试验表明[49]，实验组通过服用以水溶性辅酶Q10和胶原蛋白结合为特征的液态食物补充剂，使真皮层密度得到改善，眼眶周围皱纹面积和皱纹总评分减少，皮肤光滑度得到改善。而皮肤的滋润度、真皮层的厚度、失去经皮的滋润度（TEWL）以及黏性弹性等方面的变化，则没有明显的差别。这可能是因为摄取的食物补充剂是胶原蛋白，分子较大，而非CP。

4 胶原蛋白肽目前应用的局限性和展望

4.1 提高CP 的生物利用度

局部涂抹CP和口服CP可以促进皮肤胶原蛋白的生成、抑制老化引起的胶原蛋白的降解。二者既有区别，也有联系。从CP吸收方式上来讲，口服CP在小肠被吸收，进入血液循环。有证据表明，进入血液循环的功能性肽可以转移到皮肤上，并代谢发挥作用[50]。CP经皮主要通过角质层、毛囊、汗管及皮脂腺4条途径吸收而不进入体循环，其中后3 者常被称为旁路途径[51]。局部涂抹CP很重要的一个问题，就是渗透到真皮里面的渗透性比较低。皮肤外层的渗透取决于不同的因素，如：物质（分子大小，稳定性，结合性，溶解性）的物理化学性质不同，穿透的时间刻度，皮肤的厚度与成分，皮肤新陈代谢，皮肤的部位、区域和应用持续时间特点，透皮装置[52]。研究表明，一些合适的参数能够增强并保证皮肤上局部产品的传递。这些参数与小于500da的分子量、介于1和3之间的辛醇/水分配系数、小于200°C的熔点、＞1mg/mL的水溶解度以及极少的极性中心有关[53]。角质层通常被认为是一种实体结构，采用积极的绕过角质细胞的方法来递送CP是值得期待的。包括：微针阵列，角质层消融，电辅助方法（超声，离子渗透疗法，电穿孔等）[51]。与一般的口服药物递送系统不同，局部应用CP不需要经皮渗透入血，因此提高CP透皮吸收效率和皮肤停留时间是有广泛应用前景的。

4.2 CP 具体生物活性成分的鉴定

CP作为皮肤抗老化的营养品、化妆品已被广泛应用，但其中具体的抗老化生物活性成分却有待更深层次的考察。Pro-Hyp和Hyp-Gly二肽在成纤维细胞的增殖中起重要作用[54]。口服含Pro-Hyp和Hyp-Gly更多的CP，能更好地提高皮肤水合度、减少皱纹、增加皮肤弹性[55]。值得注意的是，两种CP对成纤维细胞有趋化作用，Pro-Hyp可以促进成纤维细胞合成HA。鱼鳞制备的CP，在体内以双肽形式（Gly-Pro和Pro-Hyp）吸收，降低了皮肤中MMP-1的产生，增加了成纤维细胞中1型前胶原的合成，对UVB诱导的体内光老化的起保护作用[56]。Liu等[57]收集了口服后含胶原肽（CPS）的血清和从血清代谢物（SCP）中分离的胶原肽，SCP通过激活TGF-β/SMAD通路来促进胶原合成。抑制AP-1、MMP1和MMP3蛋白表达抑制胶原蛋白降解，从而起到修护效果。值得注意的是，血清代谢物中的IO（Ile-Hyp）和AOG（Ala-Hyp-Gly）两种肽段被鉴定为通过激活TGF-β/Smad3途径促进胶原前合成的活性肽。

目前的研究中，CP通过MAPK/AP-1信号通路抑制MMP的合成，进而抑制胶原蛋白的降解，同时激活TGF-β/Smad信号通路，促进胶原蛋白的合成[6]。但是，CP的功能肽段、结合受体、代谢途径尚未完全阐明。胶原蛋白水解产物成分复杂，分子质量分布较广，为了分析CP具体的功能肽段，对胶原蛋白水解产物进行检测具有必要性。CP分子质量检测方法有凝胶电泳法、尺寸排除色谱法、高效液相色谱与电喷雾-质谱联用、液相色谱-质谱联用、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱，其中基质辅助激光解析电离飞行时间质谱具有快速、灵敏度高，分析质量范围大的优点，被认为检测胶原蛋白水解物分子质量的最佳方法[12]。

4.3 口服与外用相结合

口服CP与局部涂抹应用CP相结合正成为CP研究的新趋势口服和外用CP的作用部位、机理不同[58]。局部应用CP的患者，表皮深层水合作用改善。口服CP的患者皮肤的弹性得到改善，毛孔减少。局部应用CP与口服CP在皮肤抗老化中起协同作用，二者的作用是互补的而不是等效的，因此，将局部应用CP与口服CP两种摄入方式结合起来具有重要意义。

5 讨论

文章从CP局部涂抹应用的抗氧化作用、抗糖化作用、抗炎作用综述了局部涂抹CP可能通过抑制氧化应激、降低AGEs、调节皮肤炎症微环境来修复皮肤的内源性和外源性老化。并将口服CP的相关作用与局部涂抹应用CP进行比较。口服低分子量CP可以作为一种保健功能食品成分来改善人体皮肤的水合作用、弹性和皱纹。局部涂抹应用和口服CP在递送机制和修复机制上有所不同。改进CP的递送载体，提高递送效率有助于更好的发挥CP抗老化的作用。尽管摄入CP有许多好处，但是仍然缺乏大规模的临床研究来证实，现有的证据仍是有限的、不标准的。CP未来在医用耗材、保健食品、化妆品行业有着令人期待的前景。