三种贝母的核基因（ITS）序列分析

敬雨洁，黄 娇，张莹丹，帅雨瑶，谭紫君

（乐山师范学院生命科学学院，四川乐山 614000）

贝母属（FritillariaL.）为百合科百合亚科百合族的重要类群，中国贝母属植物共有24 种2 变种[1]，主要分布在西南部的青藏高原及横断山区，新疆地区，长江中下游地区及东北地区，其中14 种2 变种为我国特有种。分布于青藏高原及横断山区的贝母植物是川贝母及其近缘种，它们在分子系统树上聚为了一支，共囊括了9种和1变种，被称为“川贝母复合群”[2-3]。川贝母为我国重要的中药资源，是道地药材，其鳞茎具有镇咳祛痰、平喘、抗癌、抗菌消炎等作用。川贝母近缘种在外形上与川贝母常常混淆，尤其是川贝母与华西贝母，野外形态特征鉴定极为相似，要从形态特征上准确识别川贝母与华西贝母常有一定困难。

在野外采样中，我们在四川西岭雪山和峨眉山分别采得了三种贝母，从形态学上鉴定为川贝母、华西贝母和峨眉贝母。为了准确识别这三种贝母植物，我们分别测序了三种贝母的nrITS 序列，比较三者的核基因序列的差异，同时从GenBank 数据库中下载了三种贝母所有的nrITS 序列，与采集所得贝母的nrITS 序列进行综合比较分析，在此基础上，通过分子系统发育树探讨了三种贝母的系统位置和分类鉴定。目前尚未见对峨眉贝母的nrITS序列的研究报道，本研究旨在为川贝母及其近缘类群的分子分类鉴定提供相应的依据。

1 材料与方法

1.1 样品和试剂

川贝母1 号、华西贝母1 号从西岭雪山采集获得，峨眉贝母1号、2号从峨眉山采集获得，由乐山师范学院黄娇副教授鉴定，所有采集的样品都是来自经硅胶快速干燥的新鲜叶子，其余的序列在GenBank 中下载（见表1）。

表1 贝母样品来源

植物DNA 提取试剂盒、琼脂粉、Gold View™、Marker DL 2000 plus、2×Taq Master Mix 购自康为世纪生物科技有限公司；ITS 序列扩增引物购自上海生物工程技术服务有限公司。所用各种试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 样品总DNA提取

根据康为世纪植物DNA 提取试剂盒所述步骤进行操作，提取样品中的DNA。

1.2.2 PCR扩增及测序

通过文献查找，确定扩增ITS 序列的引物为通用引物序列（见表2）。在PCR 管内配置30 μL 的反应体系，如表3 所示。混匀后，用封口膜封口。PCR 仪循环程序设置94 ℃预变性2 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃复性1 min，72 ℃延伸10 min，共计35个循环[3]。PCR 扩增完成后，用1%的琼脂糖凝胶对2 μL PCR 产物进行电泳分离，观察胶上是否有预计的条带，用Gene Genius &Gene Gnome 凝胶成像系统观察并拍照，将有条带的PCR 产物片段送去成都生工生物科技有限公司进行双向测序。

表2 ITS序列DNA条形码引物

表3 PCR管内反应体系

1.2.3 数据处理

获得测序结果后，利用Seqman软件进行序列的拼接，把低质量序列和引物部分去除，再将序列提交GenBank，申请序列登录号。利用MEGA 6.0 软件分析序列特征，结合GenBank 上下载的其余川贝母、华西贝母序列进行分析对比，以及变异位点分析，并建立NJ系统发育树，设置bootstrap为1 000次重复[4]。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增产物的检测结果

所有样品均得到ITS 片段扩增产物，片段大小约在750 bp，PCR产物用凝胶电泳检测有单一清晰条带，无拖尾现象（见图1）。由于3、7 两个川贝母样品和4、6两个华西贝母样品，以及2、5两个峨眉贝母2号样品的ITS 序列碱基完全一致，故以下分别只对1 个序列结果进行分析。

图1 三种贝母PCR扩增产物的检测结果

2.2 三种贝母ITS碱基序列及片段的特征结果

经过序列比对，峨眉贝母1 号与峨眉贝母2 号的ITS 序列碱基非完全匹配，前者的ITS 序列总长度为707 bp，后者为724 bp，18S rDNA 长度峨眉贝母1 号为46 bp，峨眉贝母2号为55 bp，ITS1、5.8S rDNA 和ITS2二者均为212 bp、161 bp和238 bp，28S rDNA长度峨眉贝母1 号为50 bp，峨眉贝母2 号为58 bp（见图2）。川贝母的ITS 序列总长度为723 bp，18S rDNA 长度为55 bp，ITS1 长度为212 bp，5.8S rDNA 长度为161 bp，ITS2 的长度为237 bp，28S rDNA 长度为58 bp；华西贝母的ITS 序列总长度为715 bp，18S rDNA 长度为56 bp，ITS1 长度为212 bp，5.8S rDNA 长度为161 bp，ITS2 的长度为238 bp，28S rDNA 长度为48 bp。碱基序列详见图3、图4。

图2 峨眉贝母1号（左）和峨眉贝母2号（右）ITS碱基序列

图3 西岭雪山川贝母ITS碱基序列

图4 西岭雪山华西贝母ITS碱基序列

2.3 不同贝母样品的ITS序列比较

将三种贝母的ITS 序列与GenBank 中下载的共21条ITS 序列进行比较（见表4）。由表可知，所有序列总长度在612～730 bp，序列长度变化幅度不大。其中以华西贝母2 号、新疆贝母的序列长度最短。在核苷酸组成含量上，A 含量为17.7%～20.1%，T 含量为16.6%～18.2%，G 含量为32.8%～34.2%，C 含量为29.2%～31.1%，各种贝母样品的A、T、G、C 含量差别不大，GC含量为62.4%～65.3%，远高于AT含量。

表4 不同贝母样品的ITS序列比较

经比对后，对5'端和3'端进行裁剪，中间序列长度为630 bp，通过Mega6.0 软件序列比对分析，21 条ITS 序列检测到变异位点39 个，其中简约信息位点14个，单一突变位点25 个，分别占变异位点总数的35.89%和64.11%。所有供试样品的ITS1 为212 bp，含有变异位点19 个；5.8S 为161 bp，含有变异位点2个；ITS2 为237～238 bp，含有变异位点18 个。14 个简约信息位点分别在第16、29、66、78、96、118、122、217、420、430、501、546、556、586 位点；单一突变位点分别在第5、9、63、90、91、97、98、120、121、127、195、204、224、417、418、426、451、458、465、559、564、572、588、594、620 位点（见表5）。

表5 不同贝母样品的ITS 序列变异位点

2.4 不同贝母样品ITS序列的NJ系统发育树

由图5 可知，不同贝母样品主要分为两大枝，其中川贝母1、2、3、5、7、8、10 号，华西贝母1、2、3 号聚为一簇（支持值为76），峨眉贝母1、2 号聚为一簇（支持值93），这两簇和川贝母4、6、9、11、12、13、14 号聚为一大簇（支持值95），最后与新疆贝母、浙贝母聚为一簇，外类群郁金香和轮叶贝母在根部，说明由ITS 序列构建的NJ 系统树能将“川贝母复合群”与浙贝母、新疆贝母有效分离鉴定。在“川贝母复合群”中，本研究中样本川贝母1 号（Fritillaria cirrhosa1）与华西贝母 1 号（Fritillaria sichuanica1）聚为1簇，表示二者亲缘关系较近，较难区分；用ITS 序列能将峨眉贝母有效分离鉴定。

图5 基于ITS序列构建的贝母NJ系统发育树

3 结论与讨论

中国贝母属植物大部分以鳞茎入药，具有很高的药用价值，是著名中药材，尽管《中国药典》对贝母药材所使用的物种有明确规定，但是在民间同一地区的贝母在使用时并不区分，以川贝母为例，在青藏高原及其毗邻的横断山脉地区，该区域内的十余种贝母植物经常是不加区分地进行采集并使用，这对临床用药的有效性和安全性会造成很大的隐患。目前对于“川贝母复合群”的物种鉴别，形态学鉴定是最基本的鉴定方法，但此方法在对亲缘关系较近、形态特征差异不明显的不同种贝母植物中难以实现有效的鉴别[5-6]。

近年来随着分子系统学的发展，核糖体ITS 片段常用于物种分类鉴定研究，因其进化速率快，在植物属间和种间有较多的变异位点和信息位点，对于用来探讨植物的种内、种间，以及近缘种间变异是有效的分子手段之一[7-8]。本研究对野外采集的三种贝母的ITS 序列进行PCR 扩增和测序，对其序列特征进行分析，并结合GenBank 上下载的19条序列分析其原始序列特征及变异位点，并构建系统进化树，包含了目前GenBank 上释放的所有川贝母和华西贝母ITS 样本。结果表明，本研究中所采集的川贝母与GenBank 上释放的川贝母的ITS 序列间存在较多的变异位点，而华西贝母与川贝母之间的变异位点较少。在NJ系统树上表现为，川贝母并不聚为一支，华西贝母嵌套进川贝母种间，造成此种现象的原因可能为：1）GenBank上释放的部分川贝母和华西贝母鉴定有误；2）华西贝母还未分化完全，物种形成尚在进行之中，推测华西贝母与川贝母有非常近的亲缘关系；3）川贝母种内遗传变异较大，其遗传变异受到地理分布、种间杂交、基因渐渗等的影响[3,9]。本研究首次报道了峨眉贝母的ITS 序列，峨眉贝母两个样品间有1 个变异位点，可能是提取时操作误差引发的错误碱基序列；通过NJ系统树分析，峨眉贝母与川贝母及华西贝母能有效分离（支持值＞70），说明ITS 序列可以用于“川贝母复合群”中种间的鉴定，但是对于亲缘关系较近、分化时间较短、快速进化的种间还需要加入其他类型的DNA 条形码或基因组学手段来共同探讨。本文可为川贝母及其近缘种的种间鉴定研究提供数据支撑和理论依据。