IL-4/STAT6通路相关基因对Graves病患者外周血B淋巴细胞水平的影响*

杨 倩,查兵兵

复旦大学附属上海市第五人民医院内分泌科,上海 200240

Graves病是器官特异性自身免疫性甲状腺疾病,患病率约为1%[1]。目前认为抑制性免疫细胞功能的减弱[2],以及辅助性T淋巴细胞和B淋巴细胞功能的增强[3],导致Graves病致病性抗体促甲状腺素受体抗体(TRAb)的产生。本课题组既往研究显示CD20+B淋巴细胞在Graves病患者甲状腺组织中浸润[3],占Graves病甲状腺淋巴细胞的9%左右,外周血CD19+B淋巴细胞也显著增加[4]。但目前Graves病B淋巴细胞增多机制还有待进一步研究。

白细胞介素-4(IL-4)主要由活化T细胞产生,通过促甲状腺激素受体(THSR)免疫野生型(WT)、IL-4基因敲除的老鼠发现,只有IL-4基因敲除的老鼠不易发展成为Graves病,证实IL-4在Graves病发生中的重要作用[5]。而Graves病患者血清IL-4水平与健康人对比目前存在争议,结果不一致[6-7]。此外IL-4对于B淋巴细胞免疫调节起着重要的作用。促进B淋巴细胞增殖是IL-4被识别的第一个生物学功能[8]。后续研究还发现IL-4可促进前B淋巴细胞分化为成熟B淋巴细胞,拮抗Fas介导的B淋巴细胞凋亡,延长B淋巴细胞的寿命,促进B淋巴细胞抗体类别转换以及促进主要组织相容性复合物(MHC)-Ⅱ生成,增强抗原递呈等[8-10]。IL-4在B淋巴细胞中的转录调控作用依赖信转导和转录激活因子6(STAT6)信号[11]。STAT6属于信号转导子和转录激活子家族一员,在B淋巴细胞发育、分化以及抗体类别转化中也起着重要的作用[12]。目前IL-4/STAT6通路相关基因对Graves病患者外周血B淋巴细胞的影响尚不清楚。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2021年1-6月在上海市第五人民医院门诊及病房初发、未使用过抗甲状腺药物治疗的Graves病患者20例作为Graves病组,其中男8例、女12例,年龄21～78岁、平均(42.0±2.8)岁。选择同期在上海市第五人民医院体检健康且性别、年龄匹配的20例健康者作为健康对照组。Graves病的诊断依据美国甲状腺协会(ATA)2016年相关指南[13]。排除标准:(1)甲状腺炎及其他可引起甲状腺素水平升高的疾病;(2)近期服用过胺碘酮及其他可影响甲状腺功能的药物;(3)妊娠期女性;(4)患严重心脑血管疾病,肝、肾衰竭,肿瘤,急性感染,慢性炎症性疾病,其他自身免疫性疾病。

1.2仪器与试剂 罗氏 Cobas 800全自动生化免疫分析仪,Beckman Counter CyAn流式细胞仪。Human BD Fc BlockTM购自BD Biosciences公司,anti-human CD19购自Biolegend公司,anti-hu/mo pSTAT6购自Ebioscience公司,anti-human IL-4R购自Biolegend公司,RNA提取试剂盒、PCR试剂盒购自TaKaRa公司,IL-4 ELISA试剂盒购自Abcam公司。

1.3方法 所有研究对象采血前禁食12 h,并于次日清晨8点采血,抽取3 mL于采血管中,每人采血2管。(1)甲状腺功能及甲状腺抗体检测:取3 mL外周血送上海市第五人民医院检验科检测甲状腺功能[游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、血清游离甲状腺素 (FT4)]、甲状腺抗体[甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)、甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、TRAb]。TRAb是Graves病生化诊断指标,健康对照组未检测该抗体。(2)流式检测CD19+B淋巴细胞、IL-4受体(IL-4R)和pSTAT6:取3 mL外周血于EDTA抗凝管中,根据密度梯度离心法获得单个核细胞。向细胞悬液中加入Fc Block 抗体,4 ℃ 孵育 15 min,再加入荧光抗体anti-human CD19、 anti-hu/mo pSTAT6、anti-human IL-4R,4 ℃ 避光孵育 0.5 h。洗去未与细胞表面抗原结合的抗体后重悬细胞,上机检测IL-4R、CD19+B淋巴细胞水平。将表染后的细胞用PBS 洗涤后加入穿核液,4 ℃ 孵育45 min。再予Perm 洗涤细胞加入含荧光抗体的Perm,4 ℃ 避光孵育 40 min。一管加入Perm洗去未与细胞核内分子的抗体,再重悬细胞,上机进行pSTAT6流式检测。(3)IL-4R mRNA检测:为验证RNA-seq芯片数据的可靠性,通过磁珠分选8例Graves病患者和5例健康者外周血B淋巴细胞进行实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测验证IL-4R mRNA表达。使用TRIzol试剂提取总RNA,并按照说明书反转录为cDNA。引物设计和合成由捷瑞生物公司完成,以β-肌动蛋白(β-actin)基因为内参。RT-PCR检测严格按照说明书进行操作。RT-PCR反应条件如下:95 ℃ 30 s预变性,95 ℃ 5 s,55 ℃ 34 s,40个循环;95 ℃ 15 s,55 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s。使用2-ΔΔCt计算IL-4R mRNA的水平。(4)ELISA检测IL-4:按照人IL-4 ELISA试剂盒操作步骤进行,最后根据标准物浓度与吸光度(A)计算出标准曲线的直线方程,将A代入方程式,计算出浓度,再根据稀释倍数,算出实际浓度。

2 结 果

2.1两组甲状腺功能、甲状腺抗体比较 与健康对照组比较,Graves病组FT3、FT4、TPOAb、TGAb水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 两组甲状腺功能、甲状腺抗体水平比较[M(P25,P75)或

2.2两组CD19+B淋巴细胞比例和IL-4R水平比较 Graves病组外周血CD19+B淋巴细胞比例为(7.74±2.68)%,高于健康对照组的(3.38±1.59)%,差异有统计学意义(t=6.235,P<0.05)。Graves病患者B淋巴细胞IL-4R mRNA的水平为3.415±0.813,高于健康者的1.037±0.210,差异有统计学意义(t=5.747,P<0.05)。mRNA芯片原始文件可从GEO数据库(编号GSE136709)获取,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE136709。

2.3两组IL-4、CD19+IL-4R+B淋巴细胞和CD19+pSTAT6+B淋巴细胞水平比较 Graves病组血清IL-4水平及外周血CD19+IL-4R+、CD19+pSTAT6+B淋巴细胞水平与健康对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 血清IL-4及外周血CD19+IL-4R+B淋巴细胞、CD19+pSTAT6+B淋巴细胞组间比较或M(P25,P75)]

2.4IL-4、CD19+IL4R+B淋巴细胞、CD19+pSTAT6+B淋巴细胞与Graves病患者甲状腺功能及甲状腺抗体相关性分析 相关性分析显示,Graves病IL-4、CD19+IL4R+B淋巴细胞、CD19+pSTAT6+B淋巴细胞水平与甲状腺功能(FT3、FT4)、甲状腺抗体(TPOAb、TGAb、TRAb)均无相关性(P>0.05)。见表3。

表3 IL-4、CD19+IL-4R+和CD19+pSTAT6+B淋巴细胞水平与Graves病甲状腺功能及甲状腺抗体之间的相关性

3 讨 论

Graves病的病因目前尚未完全阐明,现认为其发病与遗传、精神因素、自身免疫系统密切相关,是多种因素共同作用的结果[14]。B淋巴细胞是Graves病自身抗体TRAb的来源,在Graves病患者外周血和甲状腺组织中均显著增加。当前研发针对B淋巴细胞的药物以期从根本上阻断Graves病异常免疫应答,成为Graves治疗的新方向[15]。可以说B淋巴细胞在Graves病发生和治疗中均发挥着重要的作用。

Graves病是以Th2免疫为主的器官特异性自身免疫性疾病,而IL-4是Th2细胞分泌的细胞因子,在Graves病患者甲状腺组织中高表达[16]。B淋巴细胞的增殖、分化需要多种细胞因子和转录因子协同作用。目前研究发现IL-4依赖STAT6在B淋巴细胞增殖、延长B淋巴细胞生存周期及减少B淋巴细胞凋亡中发挥着重要的作用[9]。IL-4在B淋巴细胞中的转录调控很大程度上依赖于STAT6。即IL-4与IL-4R结合后,激活Jak1和Jak3激酶,而后使得STAT6磷酸化(pSTAT6),磷酸化的STAT6形成二聚体进入细胞核参与目的基因的转录[17]。本课题组既往研究证实了TRAb刺激甲状腺细胞后导致甲状腺细胞自分泌IL-4,IL-4与IL-4R结合促进STAT6磷酸化,再通过促进增生相关基因Bcl-xL、Cyclin D1表达,来促进甲状腺滤泡上皮细胞增生,导致Graves病的发生[18]。IL-4/STAT6对B淋巴细胞生发中心的形成和抗体类别转换至关重要[19],但目前IL-4/STAT6对B淋巴细胞增殖、分化尚不清楚。虽然IL-4对Graves病的发病和B淋巴细胞的增殖起着重要的作用,但本研究发现血清IL-4水平在Graves病组和健康对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。

本课题组mRNA表达谱芯片结果显示参与激活B淋巴细胞增殖的IL-4R mRNA在Graves病患者B淋巴细胞中上调,并且PCR验证IL-4R mRNA在Graves病患者外周血B淋巴细胞中显著增加,但流式细胞术检测显示外周血CD19+IL-4R+、CD19+pSTAT6+B淋巴细胞水平在Graves病组和健康对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。STAT6作为重要的转录因子,参与细胞的增殖、分化以及免疫调节等许多重要的生物学效应,缺乏会导致B淋巴细胞免疫功能受损、糖酵解能力降低以及细胞形态改变,导致各种疾病的发生、发展。STAT6的活化需要IL-4介导,本课题组猜想外周血CD19+IL-4R+、CD19+pSTAT6+B淋巴细胞水平在Graves病组和健康对照组间无明显差异可能是因为本研究纳入的样本量小,Graves病组和健康对照组间血清IL-4水平无差异所致,本课题组后续将扩大样本量进行深入探讨。甲状腺微环境下CD19+IL-4R+、CD19+pSTAT6+B淋巴细胞水平尚不明确,后续需要动物实验进行验证。经过相关性分析发现,IL-4、CD19+IL-4R+B淋巴细胞、CD19+pSTAT6+B淋巴细胞水平与甲状腺功能和甲状腺抗体均无相关性。虽然B淋巴细胞和IL-4/STAT6通路在Graves病的发生、发展中起着重要作用,但IL-4/STAT6通路相关基因并不能反映Graves病的疾病状态。

综上所述,Graves病患者外周血B淋巴细胞显著增加,IL-4/STAT6信号通路相关基因可能并不影响Graves病患者外周血B淋巴细胞增殖和Graves病的疾病状态。