健脾补肾法对人结直肠癌移植瘤组织TLR4、RAGE、NF-κB及CD34、D2-40的影响

王梦涵 姚欣 袁婉婧 李梅 黄兴瑜 孙怡 曾宏亮 谢彪

摘要：目的 探討健脾补肾法对人结直肠癌移植瘤组织TLR4、RAGE、NF-κB及CD34、D2-40的影响。方法 于裸鼠右腿内侧接种人结肠癌细胞，建立人结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型，15d后脱颈处死剥离瘤体。对照组用生理盐水灌胃，实验组用健脾补肾中药灌胃，免疫组化法检测2组移植瘤组织中TLR4、RAGE、NF-κB及CD34、D2-40的表达。结果 免疫组化显示，与对照组相比，实验组的移植瘤组织中TLR4、RAGE、NF-κB的表达均明显下调（P<0.05），微血管CD34及淋巴管D2-40也明显下调（P<0.005）。结论 健脾补肾法能明显下调人结直肠癌移植瘤组织炎症受体TLR4及RAGE、核转录因子NF-κB、肿瘤新生血管标记物CD34及肿瘤新生淋巴管标记物D2-40的表达。

关键词：健脾补肾法；结直肠癌；TLR4；RAGE；NF-κB；CD34；D2-40

中图分类号：R735.3+7 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2023）03-0078-05

Effects of Spleen-and-Kidney Invigorating Method on TLR4， RAGE， NF-κB， CD34， D2-40 in Human Colorectal Cancer Transplanted Tumor Tissue

WANG Meng-han¹， YAO Xin¹， YUAN Wan-jing²， LI Mei²， HUANG Xing-yu²， SUN Yi¹， ZENG Hong-liang³， XIE Biao²

（1. Hunan University of Traditional Chinese Medicine， Changsha 410208， China; 2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine， Changsha 410005， China; 3. Hunan Institute of Traditional Chinese Medicine， Changsha 410031， China）

【Abstract】To study the effect of spleen-and-kidney invigorating method on TLR4， RAGE， NF-κB， CD34， D2-40 in human colorectal cancer transplanted tumor tissue. Methods： Human colorectal cancer cells were inoculated on the inside of the right leg of nude mice to establish a subcutaneous tumor transplantation model of human colorectal cancer in nude mice and the mice was sacrificed to remove the tumor from the neck 15 days later. The control group was given intragastric administration with normal salt and the experimental group was intragastrically given with decoction for invigorating spleen and kidney. The expressions of TLR4， RAGE， NF-κB， CD34 and D2-40 in the transplanted tumor tissues were detected by immunohistochemical method. Results： Compared with that of the control group， the expressions of TLR4， RAGE and NF-κB in the experimental group were significantly down-regulated（P<0.05）， and the expressions of CD34 in microvessels and D2-40 in lymphatic vessels were also significantly down-regulated（P<0.005）. Conclusion： The spleen-and-kidney invigorating method can significantly down-regulate the expression of inflammatory receptor TLR4 and RAGE， nuclear transcription factor NF-κB， tumor neovascularization marker CD34 and tumor neovascularization marker D2-40 in human colorectal cancer graft tissue.

【Key words】Spleen-And-Kidney Invigorating Method；Colorectal Cancer；TLR4；RAGE；NF-κB；CD34；D2-40

结直肠癌在我国癌症病例中位于前5位，其发病率和死亡率也在逐年上升^［1-2］。结直肠癌目前治疗以手术切除、放化疗、靶向治疗为主，但其复发率、转移率及病死率仍较高。相较于传统手术治疗，中医药对恶性肿瘤的治疗也起到关键作用，具有多环节、多靶点的特点，是我国治疗恶性肿瘤的特色疗法^［3］。肾为先天之本，脾为后天之本，脾肾不足则气血生化乏源，使脏腑功能失调，气血津液运行不畅，痰湿瘀毒内阻，日久则产生肿瘤。通过采取健脾补肾法治疗结直肠癌能够改善气血津液的运行，提高机体的抵抗力，改善患者的生活质量。

肿瘤的增殖与炎症微环境、肿瘤新生血管及淋巴管有密切关系。TLR4的表达在启动炎症反应、调节肿瘤周围的炎性环境起着关键作用^［4］。

研究发现，晚期糖基化终末产物受体（RAGE）与炎性反应、肿瘤侵袭力及血管再生均有关联^［5］。核转录因子NF-κB作为炎症的主要调节因子，在肿瘤的发生发展过程中发挥关键作用^［6］。研究发现，结直肠癌组织中微血管CD34、微淋巴管D2-40表达明显高于其在癌旁组织及正常组织^［7-8］，CD34、D2-40的表达上调可能在结直肠癌发生发展有重要作用。本实验以人结直肠癌移植瘤组织为研究对象，通过免疫组化法检测2组移植瘤组织中炎性受体TLR4、RAGE，核转录因子NF-κB及微血管CD34、微淋巴管D2-40的表达情况，探讨健脾补肾法对人结直肠癌移植瘤组织的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF及裸鼠16只，雌雄各半，体重（18±2）g。购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司（动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004；动物使用许可证号：SYXK（湘）2020-0008）。自由饮水和进食，动物房恒温24℃，相对湿度60%。

1.2 主要仪器 石蜡包埋机（YB-8LF）、轮转式切片机（RM2245）、生物组织摊烤片机（湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司 YT-7F型）、自动组织脱水机（HP300）、显微镜（奥林巴斯 BX53）、细胞培养基（DMEM）。

1.3 药品与试剂 健脾补肾类中药颗粒购买于湖南中医药大学第二附属医院（人参、黄芪、砂仁、白术、茯苓、陈皮、半夏、山药、女贞子、墨旱莲、菟丝子、枸杞、鸡血藤、白花蛇舌草、三七、半枝莲、甘草），每袋含13.8 g，用热水调制成77 mL的中药溶液（等效浓度）。NF-κB抗体、RAGE抗体、TLR4抗体、CD34抗体、D2-40抗体均购买于北京博奥森生物技术有限公司。人结直肠癌细胞株（HCT116）购自中国科学院上海细胞库。

1.4 分组、造模及给药 16只裸鼠适应约一周后进行肿瘤模型的建立。于右腿内侧皮下注射人结直肠癌细胞株（HCT116）0.15 mL（含细胞1×10⁷个）。造模后随机分成对照组及实验组，每组各8只。对照组灌胃0.9%氯化钠溶液0.4 mL·d^-1，实验组灌胃健脾补肾类中药23.4 g·kg^-1，2组均隔天给药1次，连续14 d。

1.5 取材 15d时脱颈处死裸鼠，剥离瘤体，眼科剪将其剪成两块，一块常规石蜡包埋，一块置于-80℃冰箱冻存待用。

1.6 免疫组化检测肿瘤组织NF-κB、RAGE、TLR4、CD34、D2-40的表達 石蜡包埋组织切片、脱蜡处理、流水冲洗后用蒸馏水浸泡5 min；将切片置于pH值6.0的柠檬酸钠缓冲液中煮沸15 min、流水冲洗；将切片浸泡于3%过氧化氢溶液20分钟、PBS冲洗三次；封闭后分别加一抗NF-κB（1∶100）、RAGE（1∶100）、TLR4、CD34，4 ℃冰箱过夜，加二抗37℃烤箱内孵育30 min、PBS冲洗三次；DAB显色、苏木素染液衬染；脱水、透明、封片。评判标准：由病理科医师进行阅片。

NF-κB、TLR4显示胞质及胞膜阳性（有黄色或棕褐色颗粒）、RAGE显示胞核及胞质阳性（有黄色或黄棕色颗粒）。阳性细胞<5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分别对应0，1，2，3，4分。

微血管CD34及微淋巴管D2-40均在每张切片取5个400倍视野数血管及淋巴管总数，然后取其平均值。

1.7 统计学方法 采用 SPSS 25.0 软件进行统计分析，计量资料采用 均数±标准差（x±s）表示，2组间比较符合正态分布采用t检验，不符合正态分布采用秩和检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 2组裸鼠移植瘤组织TLR4、RAGE、NF-κB免疫组化表达情况 结果显示，TLR4、RAGE、NF-κB在对照组中呈现高表达，经健脾补肾中药干预后，与对照组相比，实验组移植瘤组织中TLR4、RAGE、NF-κB的表达明显下调，其差异均具有统计学意义（P<0.05），见图1、表1。

2.2 2组裸鼠移植瘤组织微血管CD34、微淋巴管D2-40免疫组化表达情况 结果显示，经健脾补肾中药干预后，与对照组相比，实验组移植瘤组织中的血管CD34及淋巴管D2-40明显减少，其差异均具有统计学意义（P<0.005），见图2、表2。

3 讨论

结直肠癌属中医学“肠溜”“肠澼”“积聚”等范畴。中医学认为，本虚标实是结直肠癌的病机特点，本虚为脾肾亏虚，标实为湿热毒邪积聚。健脾补肾法以益气补肾健脾为主，兼以解毒消肿散结，从而达到“扶正不助邪，驱邪不伤正”的目的。现代药理研究表明，人参具有抗肿瘤、抗衰老、调节神经、调节免疫等多种生物活性^［9］，茯苓具有抗炎和抗肿瘤的作用^［10］，黄芪、白花蛇舌草也具有抗癌作用^［11-12］，补肾类中药可改善肾功能，延缓肾功能衰竭进展^［13］。

近年研究表明，慢性炎癥与肿瘤的发展密切相关，而介导炎症的TLR4、RAGE、NF-κB在许多癌细胞系和肿瘤组织都有表达，且与大部分癌症的发展情况正相关^［14-15］。中医药在治疗肿瘤疾病时也能下调TLR4、RAGE、NF-κB的表达^［16］。本次实验发现健脾补肾法能够下调人结直肠癌移植瘤组织中TLR4、RAGE、NF-κB的表达，表明健脾补肾法能对抑制人结直肠癌移植瘤的增殖有效果。

健脾补肾法抑制肿瘤增殖可能通过减少肿瘤新生血管及淋巴管有关。CD34是一种在血管内皮细胞、某些干细胞及祖细胞等表达的跨膜糖蛋白，是目前肿瘤新生小血管特异性相对较好的标记物^［17］。CD34阳性血管的微血管密度与结直肠癌的进展和预后有关^［18］。D2-40是肿瘤微淋巴管的特异标记物，对微淋巴管内皮具有选择性免疫反应性，研究表明肿瘤组织微淋巴管内皮细胞的D2-40的表达要高于癌旁组织^［19］。本次实验发现健脾补肾法能下调人结直肠移植瘤组织中CD34、D2-40的表达，说明健脾补肾法能抑制人结直肠癌移植瘤的增殖。

健脾补肾法通过下调人结直肠癌移植瘤组织TLR4、RAGE、NF-κB的表达，同时下调人结直肠癌移植瘤组织CD34、D2-40的表达，说明健脾补肾法能抑制肿瘤新生血管及淋巴管的形成，从而破坏肿瘤的生存环境，抑制肿瘤的增殖，并且可能通过TLR4/RAGE/NF-κB途径，其具体作用机制仍需进一步研究。

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（收稿日期：2022-05-18）