PFKFB4对骨肉瘤细胞增殖和迁移侵袭能力的影响及其机制探讨

艾登超,董竹林

(天津市泰达医院 骨科,天津300457)

骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是最常见且最具侵袭性的骨肿瘤,患者多为儿童、青少年和青年,早期及出现频繁复发和转移是其主要特点[1]。人群中OS的年发病率为每百万人中2-3人,15-19岁青少年发病率最高,为每百万人中8-11人。OS常见于长骨,如股骨、胫骨和肱骨,而较少发生于颅骨、下颌和骨盆[2]。尽管手术可切除疾病的患者可能会存活很长时间,但复发和不可切除疾病患者的预后仍不令人满意。OS的总体预后在过去30年中没有显著改善[3]。因此,研究OS发生发展机制,开发新的治疗靶点成为当前研究的热点。

代谢重编程是癌症进展的主要标志之一。即使在正常的氧合条件下,癌症细胞仍然选择通过糖酵解将葡萄糖转化为丙酮酸,这一现象被称为Warburg效应,该效应是代谢重编程的重要组成部分[4]。细胞内果糖2,6-二磷酸(fructose 2,6-bisphosphate,F2,6BP)水平对控制细胞糖酵解速率起到重要作用,它可增强6-磷酸果糖-1-激酶(6-phosphofructo-1-kinase,PFK-1)与果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate,F6P)的结合,并克服ATP对PFK-1的抑制,促进果糖-1,6-二磷酸(fructose-1,6-bisphosphate,F1,6P2)的合成,推动糖酵解过程。F2,6BP的浓度由磷酸果糖激酶2/果糖-2,6-二磷酸酶(phosphofructokinase 2/fructose-2,6-bisphosphatase,PFKFB)控制[5]。

已有报道表明,PFKFB家族在多种肿瘤中存在异常表达并在促进肿瘤进展中发挥重要作用。尽管PFKFB(PFKFB1-4)的4种同工酶的核心催化域具有较高的序列同源性(85%),但它们的催化特性具有很大差异。因此,尽管对PFKFB4促进肿瘤进展的相关机制已在包括骨肉瘤在内的多种肿瘤中得到充分揭示,PFKFB4在骨肉瘤中的作用及其具体机制仍亟待探索。因此,本研究拟在两种骨肉瘤细胞系中进分别敲低或过表达PFKFB4,并探讨其对细胞生物学行为的影响以及内在机制,为骨肉瘤药物靶点的鉴定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人成骨细胞hFOB1.19和骨肉瘤细胞系MG63、Saos-2、U2OS和HOS均购自美国模式培养物集存库(American type culture collection,ATCC)并进行了STR鉴定,细胞传代在20代以内;DMEM高糖培养基,1×PBS缓冲液购自美国Gibco公司,Seahorse Assay kit购自Agilent Technologies公司。Cell Counting Kit-8(CCK8)购自日本同仁公司,RIPA蛋白裂解液,一抗二抗稀释液、BCA蛋白定量试剂盒,化学发光ECL试剂,等均购自武汉博士德公司,兔源GADPH抗体,兔源PFKFB4抗体,鼠源AKT抗体,鼠源p-AKT抗体,过氧化物酶标记山羊抗兔IgG均购自美国Abcam公司;胎牛血清、100×青霉素-链霉素混合物购自美国Gibco公司;PFKFB4敲低小干扰RNA和过表达病毒购自上海吉凯生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 人成骨细胞hFOB1.19和骨肉瘤细胞系MG63、Saos-2、U2OS和HOS培养基配制：10%胎牛血清+90% DMEM高糖培养基+1%青霉素-链霉素混合物,于37℃,5% CO2的细胞培养箱中培养。

1.2.2细胞分组与转染 将细胞分为对照组和实验组。使用上海吉凯生物科技有限公司设计并构建的PFKFB4敲低小干扰RNA和过表达病毒,根据上述供应商提供的说明书在骨肉瘤细胞系中敲低或过表达PFKFB4基因。构建成功后,Western印迹实验用于检测敲低或过表达效率。

1.2.3CCK8细胞检测 当细胞消化后计数,在96孔板中每孔接种3000个细胞。将96孔板放于培养箱中,分别在细胞贴壁后0天、1天、2天、3天和4天加入CCK8试剂,避光培养2 h后测定吸光度。

1.2.4Transwell检测 使用具有24孔聚碳酸酯膜(8 mm孔径;美国康宁)的Transwell细胞进行细胞迁移测定。将含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(500 μl)加入下腔后,置入Transwen小室。收集150 μl不含血清的细胞悬浮液(1×106细胞/ml)铺入每个小室上层,并在37℃、5%CO2孵育24 h。以4%多聚甲醛细胞固定液固定,并用0.1%结晶紫染色。对于细胞侵袭测定,在加入细胞悬浮液之前,用Matrigel(BD Biosciences)涂覆Transwell室。

1.2.5Seahorse Assay 按试剂盒说明书进行操作。在XFe24细胞培养板(102342-100,Agilent Technologies)中每孔接种20000个细胞,并在37℃下孵育过夜。第二天,将培养基改为含有1 mM谷氨酰胺的海马XF DMEM培养基,然后将细胞在37℃下在无CO2培养箱中培养60 min,以平衡培养基pH和温度。在基线条件下监测细胞外酸化率(ECAR),并用10 mM葡萄糖、1 μM寡霉素、50 mM 2-DG处理。

1.2.6ADP/ATP比值 使用购自Sigma-Aldrich的ADP/ATP试剂盒测量ADP/ATP比率。实验操作后读取荧光值,计算ADP/ATP比率。

1.2.7QPCR 采用takara反转录试剂盒,按照说明书进行cDNA合成后,进行PCR分析。引物序列为：PFKFB4：Forward：GATCCTGAGGTCATA-GCTGCCA;Reverse：CTATCCAGGTCCTCATCT-AGCG;GAPDH： Forward： GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG;Reverse：ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA。

1.3 统计学方法使用graphpad进行数据的统计和分析,计数资料根据分组情况进行t检验或方差检验,P< 0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PFKFB4在成骨细胞系及骨瘤肉细胞系的mRNA表达水平

提取人成骨细胞hFOB1.19和骨肉瘤细胞系MG63、Saos-2、U2OS和HOS总RNA并进行反转录,并检测上述细胞中PFKFB4的相对表达量。QPCR实验结果发现,与人成骨细胞hFOB1.19相比,骨肉瘤细胞系MG63、Saos-2、U2OS和HOS内PFKFB4的mRNA相对表达量均有升高,见图1。

图1 人成骨细胞hFOB1.19和骨肉瘤细胞系MG63、Saos-2、U2OS和HOS内PFKFB4的mRNA相对表达量

2.2 PFKFB4高表达增强骨肉瘤细胞的增殖及迁徙侵袭的能力

以小干扰RNA或慢病毒分别转染骨肉瘤细胞系MG63及HOS,敲低或过表达细胞内PFKFB4水平,Western Blot实验结果显示,与对照组相比,MG63细胞系内的PFKFB4蛋白表达水平显著下调,而HOS细胞系内的PFKFB4蛋白表达显著增强。接下来,我们进一步检测了PFKFB4表达水平对骨肉瘤细胞生物学行为的影响。CCK8检测发现,与对照组相比,在MG63细胞系敲低PFKFB4蛋白表达水平可显著下调细胞增殖能力,而在HOS细胞系内过表达PFKFB4蛋白表达后,其增殖能力得到显著增强。Transwell实验检测则发现,与对照组相比,PFKFB4敲低组迁移及侵袭能力得到显著抑制,而PFKFB4过表达组的迁移及侵袭能力显著增强,见图2。

图2 PFKFB4表达水平与骨肉瘤细胞的增殖及迁徙侵袭的能力显著相关 A)B)CCK8实验检测敲低或过表达PFKFB4后两种细胞的增殖能力; C)Transwell实验检测敲低或过表达PFKFB4后两种细胞的迁移能力;D)Transwell实验检测敲低或过表达PFKFB4后两种细胞的侵袭能力

2.3 PFKFB4介导骨肉瘤细胞糖酵解及ATP供应增强

通过seahorse检测试剂盒,检测敲低或过表达PFKFB4后骨肉瘤细胞的糖酵解情况。结果显示,与对照组相比,敲低PFKFB4可以有效抑制骨肉瘤细胞的糖酵解,而过表达PFKFB4则正相反。通过ADP/ATP检测试剂盒,检测敲低或过表达PFKFB4后骨肉瘤细胞的能量供应情况,发现与对照组相比,敲低PFKFB4可以干扰制骨肉瘤细胞的能量供应,而过表达PFKFB4则可增强骨肉瘤细胞的能量供应,见图3。

图3 PFKFB4影响骨肉瘤细胞糖酵解及ATP供应水平 A)seahorse实验检测敲低或过表达PFKFB4后两种细胞的糖酵解;B)ADP/ATPassay检测敲低或过表达PFKFB4后两种细胞的能量供应

2.4 PFKFB4介导骨肉瘤细胞AKT信号通路活化

Western Blot实验结果显示,与对照组相比,在MG63细胞系敲低PFKFB4蛋白表达水平可显著下调AKT蛋白磷酸化水平,而在HOS细胞系内过表达PFKFB4蛋白表达后,细胞内AKT蛋白磷酸化水平显著升高,见图4。

图4 PFKFB4影响骨肉瘤细胞AKT信号通路活化水平

3 讨论

近年来已有多篇文献针对PFKFB4在肿瘤中的表达水平以及临床意义进行了研究。Zhou等的研究发现,与正常对照组织相比,PFKFB4在肺癌组织中的表达水平显著增加;生存分析显示,PFKFF4高表达的患者预后较差;进一步分析发现,在非小细胞肺癌患者中,PFKFB4表达水平与免疫细胞浸润和免疫检查点表达显著相关[6]。在胃癌中,Wang等的研究发现,与邻近正常组织相比,胃癌组织中PFKFB4的表达上调。PFKFB4的表达与患者年龄、肿瘤大小、肿瘤T分期和TNM分期相关,在<65岁、肿瘤直径较大、T分期较晚和TNM分期较晚的患者肿瘤组织中,可观察到PFKFB4表达水平显著上调。KM生存分析表明,与PFKFB4高表达患者相比,PFKFB4低表达患者的总生存率、首次进展生存率和进展后生存时间显著提高。此外,在T晚期和TNM晚期疾病患者中,PFKFB4的表达与OS时间呈负相关[7]。此外,PFKFB4高表达与肿瘤患者预后不良显著相关还可在膀胱癌和乳腺癌中观测到[8-9]。上述研究不仅强调了PFKFB4异常表达在多种肿瘤中具有显著的临床意义,更提示我们PFKFB4可能通过多种机制推动了肿瘤的发生发展。

近年来的研究也开始针对PFKFB4促进肿瘤进展的详细机制进行探讨,并发现PFKFB4以增强糖酵解或发挥激酶活性等多种方式实现。在乳腺癌中,PFKFB4可以发挥其激酶活性,在丝氨酸857处磷酸化SRC-3并增强其转录活性,刺激肿瘤细胞增加嘌呤合成,从而增强了肿瘤细胞的增殖能力和侵袭转移能力[10]。在恶性黑色素瘤中的研究将糖酵解相关酶PFKFB4与RAS-AKT信号联系了起来。在恶性黑色素瘤中,ICMT可通过转录后修饰途径控制RAS蛋白活性。该研究发现PFKFB4通过促进ICMT/RAS相作,控制了质膜上的RAS定位,激活了AKT信号并增强细胞迁移[11]。在另一篇关于乳腺癌的研究中,研究者发现,在小鼠乳腺癌症模型中,敲低PFKFB4表达可显著抑制肿瘤远处转移。从机制上讲,低氧微环境可诱导PFKFB4出现核移位,推动HIF-1α的异常转录激活。该研究结果表明,PFKFB4的表达对于缺氧微环境中肿瘤细胞的适应至关重要[12]。

我们的研究发现,OS细胞系中PFKFB4的mRNA表达水平均高于正常成骨细胞系。与对照组相比,影响PFKFB4表达后骨肉瘤细胞的细胞增殖、迁移及侵袭能力均收到显著影响降低。我们的研究说明,PFKFB4在骨肉瘤细胞中同样存在异常高表达,且其高表达对维持促进骨肉瘤进展具有推动作用,我们的研究与上述研究得出的结论一致。不仅如此,我们的研究还发现,PFKFB4可影响OS(骨肉瘤)细胞的糖酵解速率及能量供应。

我们的数据表明,PFKFB4调节的糖酵解可以通过增强能量供应从而促进骨肉瘤细胞的增殖和侵袭。充足的ATP补充对于蛋白质磷酸化是必要条件,也是以促进细胞信号转导途径的激活所必须的[13]。我们的研究发现,在OS细胞中,改变PFKFB4表达水平可显著影响AKT通路的活化,这说明PFKFB4可能通过推动糖酵解途径,持续增加细胞内ATP供应,并影响了AKT信号通路的活化,从而刺激并维持骨肉瘤细胞的进展。

综上,在骨肉瘤中,PFKFB4可通过增强肿瘤细胞的糖酵解码,增强能量供应,从而激活AKT通路,从而最终对肿瘤进展起到推动作用;PFKFB4有望成为治疗骨肉瘤的新靶点。