角茴香醇提颗粒对H1N1 亚型流感病毒的体内抑制作用

陈召亮，张 诚，崔 欢，蒲 劼，张 磊，郭振东，刘聚祥

（1.河北农业大学 动物医学院，河北 保定 071001；2.军事科学院 军事医学研究院 军事兽医研究所，吉林 长春 130122；3.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062；4.西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621000）

A 型流感病毒又称为甲型流感病毒（Influenza A virus，IAV），是威胁人类健康的主要传染病原之一，因其常导致季节性流感疫情的发生而受到广泛研究［1-2］。自IAV 出现以来，已经在全世界范围内传播，不仅造成了相当大的经济损失，而且还严重威胁到了全球公众健康［3］。

中药在预防和治疗传染性疾病上，有着悠久的历史，许多经典方剂，如麻杏石甘汤、银翘散等，对于治疗流感都有着良好的效果［4］。种类繁多的中药被广泛应用于流感病毒及流感病毒性肺炎的基础和临床研究，是抗病毒药物研发的重要资源［5］。在众多研究成果中，许多中药已显示出一定的疗效，但仍需要更多高质量的实验设计和临床对照研究，从而进一步开发流感的治疗药物［6］。

中药角茴香为罂粟科（Papaveraceae），角茴香属（Hypecoum erectumL.）植物细果角茴香（Hypecoum leptocarpumHook.f.et Thoms.，HL）或直立角茴香（H.erectumL.）的干燥全草，是一种地区性习用药材，常在少数民族地区作为藏药和蒙药使用，作为藏药时，普遍以细果角茴香入药，又称巴尔巴达［7］。角茴香含有多种生物碱，其具备多种生物学活性，如抗炎作用［8］、镇痛作用［9］、抗菌作用［10］。角茴香能够作为流感治疗药物使用，这在我国多部中药相关典籍中均有提示，如《西藏常用中草药》中记载，其可治伤风感冒、头痛，可解食物中毒［11］；《中华本草》称其能治感冒发热、咳嗽、咽喉肿痛［12］。有研究证实，角茴香水提物对MDCK 细胞中的H3N8 亚型流感病毒具有明显的抑制作用，可以在体外显著降低流感病毒的感染性［13］。然而，角茴香及其活性成分在体内对流感病毒的影响作用鲜有报道。

因此，本研究使用A/PR/8/33（H1N1）流感病毒接种BALB/c 小鼠，建立流感病毒感染小鼠模型，并使用不同浓度的细果角茴香醇提颗粒剂药液给药治疗，通过多种指标评价角茴香醇提颗粒剂对小鼠体内流感病毒的抑制作用及对流感病毒感染小鼠的治疗效果，以期为新型抗流感药物研发相关研究提供理论和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物与病毒毒株 BALB/c 小鼠，雌性，体重18～20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；9 日龄无特定病原体（SPF）鸡胚，购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。

甲型流感病毒，A/PR/8/33（H1N1），由中国农业科学院长春兽医研究所保存，并在9 日龄SPF鸡胚中进行扩增。扩增之后，测定其在MDCK 细胞中50%组织细胞感染量（TCID50）和在BALB/c 小鼠中的半数致死量（LD50）。TCID50和LD50通过Reed-Muench 方法计算得到。

1.1.2 试验药物与试剂 角茴香醇提颗粒（HL），将细果角茴香原生药材使用乙醇回流提取、浓缩，并经流化床制粒制备得到，由保定厚棋生物科技有限公司制备完成。每1.0 g 颗粒相当于原生药材1.50 g。奥司他韦，购自阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）。

BioFlux Simply P 总RNA 提取试剂盒，购自杭州博日科技股份有限公司；Prime Script™ RT 试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司；Power SYBR™Green PCR Master Mix 试剂盒，购自赛默飞世尔科技公司（美国）；Elisa 试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 不同浓度角茴香醇提颗粒药液的制备 分别称量1.665、0.832 和0.416 g 的醇提颗粒溶解于100 mL 磷酸盐缓冲溶液（PBS）后，加热，搅拌直至完全溶解。使用0.22 μm 的1 次性过滤器过滤除菌后，分别制备得到质量浓度为16.65、8.32 和4.16 mg/mL 的高、中、低浓度角茴香醇提颗粒药液。

1.2.2 小鼠的感染与治疗 参考BALB/c 小鼠的流感病毒感染模型［14-15］。建模前，将小鼠随机进行分组，分为空白对照组（NC）、病毒对照组（NC）、奥司他韦对照组（OS）、低剂量治疗组（HL-L）、中剂量治疗组（HL-M）和高剂量治疗组（HL-H），共6 组。除空白对照组外，其余各组小鼠经异氟烷麻醉后，滴鼻接种H1N1 亚型流感病毒，50 μL/只（2 LD50/50 µL），由此建立得到流感病毒感染小鼠模型。

除空白对照组以外，其余各组小鼠在建立流感病毒感染小鼠模型2 h 后，于感染当天开始给药治疗。其中，HL-L、HL-M、HL-H 治疗组小鼠分别使用低、中、高浓度的角茴香醇提颗粒药液给药治疗，100 μL/只；奥司他韦对照组小鼠使用奥司他韦治疗，治疗剂量参考先前的报道，以5 mg/mL 的浓度在PBS 中进行稀释，以20 mg/kg 的剂量给药治疗［16］；病毒对照组小鼠使用PBS 作为对照，100 μL/只。给药方式均为灌胃给药，1 天1 次，并在每天的同一时间进行给药。

1.3 检测指标与样品采集

1.3.1 体重变化率、发病率和小鼠存活率 将60 只雌性BALB/c 小鼠随机分为6 组，分组方式如前所述，每组10 只。除空白对照组以外，其余各组小鼠在建立流感病毒感染小鼠模型2 h 后，于感染当天开始给药治疗，连续治疗5 d。并于给药治疗后，每天对各组小鼠进行称重，记录小鼠的发病率、体重、存活数，连续记录14 d。

1.3.2 肺指数及肺脏中的病毒滴度变化 将120 只

BALB/c 小鼠随机分为6 组，分组方式如前所述，每组20 只。除空白对照组以外，其余各组小鼠在建立流感病毒感染小鼠模型2 h 后，于感染当天开始给药治疗，连续治疗5 d。各组分别于感染后第3、5、7 天随机取5 只小鼠，记录体重。采集小鼠肺脏，称重，计算肺指数（肺指数=肺脏重量/小鼠体重）。之后，将采集得到的小鼠肺脏组织分成3 部分，第一部分用于研磨、匀浆后测定其病毒滴度（TCID50），病毒滴度（TCID50）采用Reed-Muench 法计算；第二部分用于观察病理组织学变化；第三部分用于提取RNA，并进行细胞因子相关mRNA 表达水平的测定。

1.3.3 肺组织病理变化 将上述所采集到的小鼠肺组织，置于4%多聚甲醛中进行固定，至少24 h。之后，使用石蜡包埋组织样品，并将样品切成4 mm厚的切片，苏木精和伊红（HE）染色。在光学显微镜下观察各组小鼠肺组织样品的病理变化。

1.3.4 血液指标的变化 各组分别于感染后第3、5、7 天随机取5 只小鼠，在采集肺脏之前，于全麻状态下采集小鼠EDTA 抗凝血液。EDTA 抗凝血液用于血常规检测，按照全自动血细胞分析仪的说明书，对采集的小鼠血液进行检测。根据检测结果分析不同组小鼠的血细胞差异。

1.3.5 肺脏中细胞因子相关mRNA 表达水平变化

对于细胞因子的检测，同样使用上述所采集得到的小鼠肺组织。根据Simply P 总RNA 提取试剂盒提供的方法提取小鼠肺组织的总RNA，之后使用Prime ScriptTMRT试剂盒对提取的RNA进行反转录，获得cDNA。然后使用Power SYBRTMGreen PCR Master Mix 试剂盒，利用染料法qPCR 测定小鼠肺组织中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的mRNA表达水平，所有操作均严格按照试剂盒的说明书进行。目标基因所需的引物均由吉林省库美生物科技有限公司合成，各特异性引物的序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

qPCR 在ABI 7500 快速实时PCR 系统上进行。扩增程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 个循环。肺组织中各细胞因子的基因相对表达量采用2-ΔΔCt法计算得到。

1.3.6 血清中细胞因子表达水平变化 各组分别于感染后第3、5、7 天随机取5 只小鼠，在采集肺脏之前，全麻状态下采集小鼠普通非抗凝血液。普通非抗凝血液用于收集血清。根据试剂盒的操作要求，测定各血清样本中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

1.4 统计学分析

试验所得数据使用GraphPad Prism 8.0.2 软件进行分析统计。组间比较通过单因素方差分析（ANOVA）评估统计学差异，P＜0.05 时认为差异具有统计学意义。计量资料表示为平均值±标准差（±SD）。差异显著性标志按照如下方式表示。

与空白对照组相比：###P＜0.001，##P＜0.01；与病毒对照组相比：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2 结果与分析

2.1 角茴香对流感病毒感染小鼠的保护作用

连续14 d 观察和记录6 组小鼠（NC 组、VC 组、OS 组、HL-L 组、HL-M 组和HL-H 组）的发病率、存活率和体重变化情况，以确定HL 对IAV 感染小鼠的保护作用（图1）。

图1 角茴香对流感病毒感染小鼠的保护作用Fig.1 Protective effect of HL on influenza virus-infected mice

在整个研究观察期间，HL-H 组小鼠的表现反映出了良好的保护作用。在感染后第1 天，病毒对照组开始出现临床症状，如活动量减少，皮毛竖起，呼吸急促。而奥司他韦对照组和HL-H 组分别在病毒对照组开始出现临床症状的2 d 和3 d 后才出现临床症状。相比于病毒对照组，HL-L 组和HL-M 组也延迟了临床症状的出现时间。

病毒对照组小鼠在感染后第4天开始出现死亡，到第10 天全部死亡。而奥司他韦对照组和HL-H 组分别在感染后第5 天和第6 天开始出现死亡，直到观察期结束，小鼠仍有存活，保护率为60%。HL-M组和HL-L 组也减少了流感病毒感染小鼠的死亡数量，保护率分别为50%和30%。

空白对照组小鼠在整个试验期间，体重呈上升趋势。病毒对照组小鼠在存活期间，体重持续下降，下降幅度约为20%。奥司他韦对照组和3 个治疗组（HL-L 组、HL-M 组和HL-H 组）的小鼠体重呈现先降后升的趋势，体重损失均小于病毒对照组。

2.2 小鼠肺脏中的病毒滴度及肺指数的变化

测定不同时间点小鼠肺部的病毒滴度和肺指数，以研究HL 对IAV 感染小鼠肺部的保护作用，结果如下（图2 和图3）。在感染后第5 天，病毒对照组的病毒滴度和肺指数均显著高于空白对照组。与病毒对照组相比，奥司他韦对照组和3 个治疗组（HL-L、HL-M、HL-H）的肺指数和病毒滴度均有不同程度的降低，其中，奥司他韦对照组和HL-H组的降低程度最为明显。这说明HL-H 和奥司他韦对IAV 感染小鼠肺部的保护作用较为突出。

图2 感染后不同时间的小鼠肺部病毒滴度Fig.2 Lung virus titers in mice at different times after infection

图3 感染后不同时间的小鼠肺指数Fig.3 Lung indiex of mice at different times after infection

在感染后的第3 天和第7 天，各组变化趋势与感染后第5 天大致相同，但变化程度均没有感染后第5 天明显。

2.3 HL 对IAV 感染小鼠肺部炎症的抑制作用

由小鼠感染后不同时间点的肺脏中病毒滴度及肺指数变化可知，在小鼠感染后第5 天，HL 各治疗组有着最佳的治疗效果。对感染后第5 天的各组小鼠肺部进行HE 染色，其组织学变化如下（图4）。

图4 对小鼠肺部的病理观察（200×）Fig.4 Pathological observation of the lung in mice

空白对照组小鼠肺部无明显病理变化，而病毒对照组小鼠肺部出现明显的肺泡壁增厚（绿色箭头）、炎性细胞浸润（红色箭头）、上皮细胞坏死（黑色箭头）等病理损伤现象。而奥司他韦和HL 可以显著改善这些组织损伤。HL-H 组和奥司他韦对照组的肺部损伤减少最为明显，对肺部炎症反应的抑制作用最强。

2.4 HL 对IAV 感染小鼠血液指标的改善

对感染后第5 天的各组小鼠进行血常规检测，结果如下（图5）。与空白对照组相比，病毒对照组的4 种血细胞水平均显著下降。相较于病毒对照组，奥司他韦对照组和3 个治疗组（HL-L、HL-M、HL-H）的4 种血细胞均有所上升，其中，奥司他韦对照组和HL-H 组的上升最为显著。

图5 血常规检测结果Fig.5 Routine blood results of mice

2.5 细胞因子的表达水平

2.5.1 肺组织中细胞因子相关mRNA 表达水平 本研究对感染后第5 天的小鼠肺组织中细胞因子相关mRNA 的表达水平（TNF-α、IL-1β 和IL-6）和血清中细胞因子的表达水平（TNF-α、IL-1β 和IL-6）进行了检测。

小鼠肺组织中的细胞因子相关mRNA 表达水平如图6 所示，病毒对照组的TNF-α、IL-1β 和IL-6均显著高于空白对照组（P＜0.05）。而奥司他韦对照组和3 个治疗组（HL-L、HL-M、HL-H）能有效抑制TNF-α、IL-1β 和IL-6 的升高，其中奥司他韦对照组和HL-H 组的效果最为明显。

图6 角茴香醇提颗粒对小鼠肺部细胞因子相关mRNA 表达的影响Fig.6 Effect of HL on cytokine-related mRNA expression in mouse lung

2.5.2 血清中细胞因子表达水平 血清中细胞因子的表达水平（TNF-α、IL-1β 和IL-6）如图7所示。病毒对照组小鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表达水平明显高于空白对照组。而与病毒对照组相比，奥司他韦对照组和3 个治疗组（HL-L、HL-M、HL-H）的小鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表达都受到了不同程度的抑制，其中奥司他韦对照组和HL-H 组对血清中细胞因子的抑制作用最为明显。

图7 角茴香对小鼠血清细胞因子表达的影响Fig.7 Effect of HL on cytokine expression in mouse serum

3 结论与讨论

甲型流感病毒（IAV）可在人和动物中引起季节性或大流行性流感，始终威胁着人类健康和公共卫生安全［2］。IAV 可以通过抗原漂移、基因重组等方式不断进化和变异，进而形成新的耐药毒株［17］。目前针对IAV 的药物治疗，主要包括美国食品和药物管理局（FDA）批准的两类抗流感药物：神经氨酸酶抑制剂（NAIs）如奥司他韦和M2 通道阻断剂，但后者却已经因普遍耐药而停止使用［18-19］。同时，病毒表面抗原的不断变化也常常是造成大流行的主要原因［20］。因此，新型抗流感药物的研发及抗病毒相关机制的研究是十分必要的。

角茴香作为一种传统中药，具有抗炎、镇痛、解热等多种功能，可用于治疗多种疾病如感冒、肺炎、肝炎、胆囊炎等［21］。本研究中，角茴香醇提颗粒表现出了对小鼠体内IAV 的明显抑制作用，并对流感病毒感染小鼠有着显著的保护作用。流感病毒感染小鼠在经过角茴香醇提颗粒剂的治疗后，发病时间推迟，存活率升高，体重损失减少。同时，角茴香醇提颗粒对小鼠的保护作用与浓度有关。分析结果可知，随着角茴香醇提颗粒治疗剂量的增加，小鼠的保护率随之增加。高浓度角茴香醇提颗粒剂对流感病毒感染小鼠的治疗效果与阳性对照药物奥司他韦相当。角茴香醇提颗粒剂在降低小鼠肺部病毒滴度的同时，也减轻了IAV 对小鼠肺脏的病理损害和IAV导致的炎症反应，在急性肺损伤的治疗中发挥了作用。

动物机体在受到IAV 感染后，体内的细胞因子水平会产生一定的变化，当细胞因子过度表达时，过多的促炎细胞因子则会导致形成不受机体控制的细胞因子风暴，从而导致肺脏及其他器官的损伤、全身炎症，甚至死亡［22］。调节细胞因子的表达水平是治疗流感病毒感染的重要手段［5］。细胞因子的过度释放——细胞因子风暴与病毒性肺炎常常是引起重症流感患者呼吸系统损伤与死亡的重要原因［23］。尽管细胞因子在抑制病毒复制方面是必不可少的，但某些促炎细胞因子不受控制的表达，会加剧疾病的发展和机体的损伤［5,24］。机体感染IAV后，TNF-α、IL-1β 和IL-6 是调节炎症反应程度的关键细胞因子［1］。TNF-α 的过度表达常常是流感病毒导致肺部病理损害的原因之一［25］。在本研究中，通过RT-qPCR 及ELISA 试验检测了各组小鼠体内多种细胞因子的表达水平。结果发现，经过角茴香醇提颗粒剂的治疗后，流感病毒感染小鼠肺脏及血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表达水平明显下降。角茴香醇提颗粒可以预防IAV 感染引起的细胞因子风暴。

综上所述，角茴香醇提颗粒能明显抑制小鼠体内H1N1 亚型IAV 的活性，减轻IAV 引起的肺部病理损伤，缓解肺部的炎症反应。中药角茴香是一种潜在的新型抗流感病毒药物。