牛DSCAM 基因的基因组印记和DNA 甲基化状态分析

靳兰杰，霍浩楠，张银蛟，李冬杰，陈玮娜，张 萃，李世杰

（1.河北农业大学 生命科学学院, 河北 保定 071000；2.河北科技大学 食品与生物学院, 河北石家庄 050018；3.河北大学 中医学院，河北 保定 071000）

基因组印记是指哺乳动物在发育过程中，一小部分基因表现为亲本特异性的单等位基因表达的表观遗传过程［1］。印记基因在胚胎和胎盘的发育，以及出生后的生长和代谢过程中发挥着关键作用。印记基因的表达受表观遗传修饰的调控，大部分印记基因受DNA 甲基化的调控，即亲本等位基因间形成一个差异甲基化区（Differentially methylated regions, DMRs），其发生在配子发生期并在整个细胞发育过程中稳定遗传［2］。

有一些印记基因参与调控神经发育过程和行为［3］，其表达紊乱会导致语言、社会认知和神经行为障碍，例如：14q32 染色体的父系单父二体（UPD）的过度表达或表达缺失会导致面部畸形；11q15.5染色体的母系等位基因过表达和父系等位基因的缺失同时发生时会导致罗素银综合征（Russell-silversyndrome, RSS）［4］。唐氏综合征细胞粘附分子（Down syndrome cellular adhesion molecule,DSCAM）基因由于最早在人类染色体21q22 上的唐氏综合征区域发现而得名［5］。DSCAM基因编码1 种免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白，在神经系统中广泛表达，参与树突形态和神经元的连接，在神经网络的建立过程中起重要作用［6-7］。人DSCAM基因为母源印记基因。牛是一种重要的经济家畜物种，与人类和小鼠相比，在牛中被鉴定的印记基因数量相对较少。目前牛DSCAM基因的印记状态和调控机制未见报道。本研究先应用基于SNP 的方法分析DSCAM基因在成年牛心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪和大脑等组织以及胎盘中的印记状态，进而分析DSCAM基因启动子区CpG 岛的甲基化状态，揭示DNA 甲基化在调控牛DSCAM基因印记表达中的作用，以期为进一步研究牛DSCAM基因的功能和印记相关的分子机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试样品的采集

印记状态分析包括成年荷斯坦奶牛的组织和胎盘。成年荷斯坦奶牛的组织取自河北省保定徐水某屠宰场，包括32 头成年荷斯坦奶牛心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪和大脑等8 个组织；15 个成年荷斯坦奶牛的胎盘取自保定满城某奶牛养殖场，同时采集每个胎盘对应的母源血液，用于人工受精的精子样本购于北京博迈德基因技术有限公司。标记样本并液氮冷藏，随后将供试样本置于-80 ℃冰箱冻存待用。

1.2 RNA 的提取及反转录

用RNAios plus 试剂盒（TaKaRa，大连）提取供试组织（心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪和大脑）和胎盘的总RNA，无RNA 酶DNase Ⅰ除去基因组DNA 污染；用UEIris ⅡRT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis（with dsDNase，US Everbright Inc，美国）试剂盒将纯化后的RNA 反转录为cDNA，-20 ℃冻存待用。

1.3 RT-PCR 扩增

通过NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站查找牛DSCAM基因的mRNA 序列（Accession No.: XM_010801644.3），用UCSC Genome Browser（http://genome.ucsc.edu/）分析基因结构，Oligo 7.0 软件针对DSCAM基因cDNA 序列设计引物F1和R1（表1），对供试组织和胎盘的cDNA 进行PCR 扩增。利用跨内含子的1 对引物GAPDH-F 和GAPDH-R 扩增一段长度为375 bp 的GAPDH（Accession NO.: BTU85042）片 段 作 为 内 参。25 μL PCR 反应体系：2.5 μL 10×LA Tap Buffer，2 μL 2.5 mmol/L/dNTPs，0.1 μL LA Taq DNA 聚合酶，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板1 μL（50 ng），ddH2O 补足25 μL。PCR 扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，30 个循环；72 ℃延伸6 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

表1 用于SNP 鉴定，等位基因分析和DNA 甲基化的引物信息Table 1 Primers used in SNP identification, allelic expression and DNA methylation analysis

1.4 基因组DNA 提取及SNP 鉴定

用DNA 提取试剂盒（上海，生工）提取各种组织的基因组DNA。依据牛DSCAM基因的mRNA 序列（Accession No.: XM_010801644.3）在DSCAM基因第32 个外显子上设计引物F2 和F2（表1），PCR 扩增一段长为996 bp 的目的片段。PCR 反应体系与RT-PCR 反应体系基本相同，除将cDNA 模板换成基因组DNA，PCR 反应程序同1.3（退火温度50 ℃，延伸时间30 s），1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，用胶回收试剂盒（Omage，美国）回收，送上海生工生物工程股份有限公司测序。利用Chromas 2.1.3软件查看测序结果，寻找重叠双峰的SNP 位点确定杂合子个体。

1.5 印记状态分析

利用跨内含子31 的F1 和R1 引物对随机选择的3 头杂合子牛的8 个组织以及3 个杂合子牛胎盘的RNA 进行RT-PCR 扩增，产物纯化回收测序，确定印记状态。若SNP 位点为双峰，则基因为双等位基因表达；若SNP 位点为单峰，则基因为单等位基因表达；需进一步通过PCR 扩增父本的精子和母本全血，对扩增产物直接测序确定亲本的基因型。

1.6 等位基因特异性DNA 甲基化分析

用DNA 重亚硫酸盐转化试剂盒处理牛单等位基因表达的组织，胎盘和精子的DNA 模板。用MethPrimer 在线软件预测牛DSCAM基因富含CpG 的启动子区并转化序列，根据转换后的序列设计甲基化特异性的半巢氏PCR 引物（表1）。将pMD19-T 载体（TAKARA）与二次扩增的胶回收产物进行连接，随后向连接产物中加入20 μL 大肠杆菌DH5α 的感受态细胞和500 μL LB 液体培养基，37 ℃摇床内200 r/min 摇菌培养40 min。向培养好的菌液中按4∶25 的比例分别加入4 μL IPTG（200 ng/μL）和25 μL X-gal（20 mg/μL），混合均匀后涂到含有氨苄青霉素（100 mg/mL）的固体LB 培养基上，倒置于37 ℃恒温箱中培养10 h。次日挑取阳性克隆于加有氨苄青霉素的液体培养基，37 ℃、170 r/min 振荡培养12 h。以培养好的菌液为模板，利用特异性甲基化内侧引物进行PCR 扩增。将培养好的菌液测序后，分析CpG 位点的甲基化状态，甲基化的CpG 位点的C 不发生变化，而非甲基化的CpG 位点的C 是则变成T。

2 结果与分析

2.1 牛DSCAM 基因在组织中的表达分析

利用分别位于外显子31 和32 的引物F1 和R1扩增得到1 条长度为385 bp 的条带（图1）；进一步回收测序，确定为目的条带，表明DSCAM基因在心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪和大脑以及器官胎盘中均有表达。

图1 牛DSCAM 基因在被检测的组织和胎盘中表达Fig.1 The expression levels of DSCAM in different tissues and placenta of cattle

2.2 牛DSCAM 基因编码区SNPs 的鉴定

用位于DSCAM基因第32 外显子上的F2 和R2 引物扩增成年牛肝脏和胎盘组织基因组DNA，在996 bp 的扩增产物上发现了1 个A/G 杂合位点（rs136908595）（图2）。在个体与胎盘中鉴定出的杂合子与纯合子的比例分别为2∶5 和2∶3。

图2 牛DSCAM 基因SNP 的鉴定Fig.2 Identification of SNP in bovine DSCAM gene

2.3 DSCAM 基因在牛组织中的等位基因表达的分析

利用跨内含子31 引物F1 和R1 对3 个杂合子牛的组织RNA 进行RT-PCR 扩增，回收长度为385 bp 的目的片段并测序。结果表明在8 个组织的测序图谱中，SNP 位点（rs136908595）处均为双峰（图3），说明DSCAM基因在牛组织中为双等位基因表达。

图3 牛DSCAM 基因在不同组织中的等位基因表达Fig.3 Allelic expression of bovine DSCAM gene in different tissues

2.4 DSCAM 基因在牛胎盘中的印记状态

利用F1 和R1 引物对3 个具有A/G 杂合位点胎盘（3501、1-12、3-7）的cDNA 进行PCR 扩增，产物直接测序发现3 个杂合子牛胎盘的SNP 位点（rs136908595）处均为单峰A，说明DSCAM基因在胎盘中为单等位基因表达（图4）。进一步对3个杂合子胎盘所对应的父源精子和母亲血液的基因型进行检测，结果发现3 个胎盘的母本基因型均为AA 纯合，而父本基因型为GG 纯合（图4），说明牛DSCAM基因在胎盘中为父源印记基因。

图4 牛DSCAM 基因在胎盘中的母源等位基因表达Fig.4 Maternal expression of bovine DSCAM gene in placenta

2.5 牛DSCAM 基因启动子区的甲基化状态

为分析牛DSCAM基因的胎盘特异性印记是否受DNA 甲基化的调控，对第一个外显子的5'端上游3 000 bp 和3'端下游2 000 bp 进行CpG 岛预测，分析了包括第一个外显子在内的402 bp 片段中13个CpG 位点在肾、大脑、脾、胎盘、精子中的甲基化状态（图5A），将纯化后产物部分用于直接测序，剩余部分用于克隆测序。在直接测序结果发现1 个SNP （rs453315548，A/G）位点来区分亲本（A 链和G 链）。根据克隆测序结果发现，胎盘1的G 链的甲基化水平为100%，A 链的甲基化水平为2.5%；胎盘2 中G 链的甲基化水平为100%，A链的甲基化水平为1.2%，2 个胎盘的G 链平均甲基化水平（100%）明显高于A 链的平均甲基化水平（1.9%）。表明在单等位基因表达的胎盘1 和胎盘2 中，该区域存在明显的差异甲基化区。在肾中A 链的甲基化水平为97%，G 链的甲基化水平为99%；在大脑中A 链的甲基化水平为99%，G 链的甲基化水平为100%，在脾中A 链的甲基化水平为97%，G 链的甲基化水平为100%。在所检测的3 个组织中，A 链的平均甲基化水平接近于G 链的甲基化水平，表明在双等位基因表达的肾脏、大脑中，该区域不存在明显的差异甲基化区，同时精子中为完全重甲基化状态（图5B）。以上结果推断，DNA 甲基化可能修饰参与调控牛DSCAM基因的胎盘特异性印记。

图5 DSCAM 基因结构及CpG 岛甲基化状态Fig.5 DSCAM gene structure and CpG island methylation status

3 结论与讨论

在哺乳动物中，由表观遗传修饰决定的亲本特异性的单等位基因表达的现象称为基因组印记，这种具有亲本特异性单等位表达的基因称为印记基因［8］。迄今为止，在人类和小鼠中分别鉴定出112［9］和186［10-11］个印记基因，而在牛中，被发现的印记基因仅为49 个［12］。牛作为一种重要的经济家畜物种，因其发育模式与人类植入前胚胎发育相似，继而成为一种潜在的研究模型［13］。印记基因的表达异常不仅会引起胚胎和胎盘的发育异常，还与家畜的一些经济性状有关，例如母系印记基因callipyge调控绵羊的后群肌肉肥大［14］，数量性状位点（QTL）的印记调控猪背膘厚度，眼肌高度和肌内脂肪含量［15］。

DSCAM基因位于人类唐氏综合征的相关区域［16］，是导致唐氏综合征病因的1 个候选基因［17］。DSCAM蛋白是免疫球蛋白超家族中最大的成员之一，在哺乳动物中高度保守［18］。本试验利用RTPCR 法揭示了DSCAM基因在成年牛组织以及胎盘广泛表达。DSCAM基因在神经系统中高表达［17］，其过度表达和表达不足都会使神经网络的形成异常。Agarwala 等人［19］利用Northern blot 印记杂交技术检测发现DSCAM基因在心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏和肌肉等非神经元组织的表达仅仅发生在成年小鼠早期发育过程中；然而，在成年小鼠中其表达仅限于大脑［19］。

Khattabi 等人［20］采用高通量基因阵列对人类胎盘中新的印记基因进行全基因组搜索，确定了DSCAM基因为人类21 号染色体上的第一个印记基因，其表现为母源印记基因。然而，Dscam基因在小鼠的大脑和胎盘中为双等位基因表达［20］。本研究中发现DSCAM基因在牛中表现为胎盘特异性的父源印记基因。由此可见，DSCAM基因在物种间的印记状态存在差异。胎盘是哺乳动物在妊娠期间母体和胎儿之间联系的枢纽，胎盘功能障碍将导致胎儿生长受限，甚至引起胎儿死亡［21］。许多印记基因表现为胎盘特异性，胎盘印记基因的表达紊乱，会破坏由胎盘介导的母体与胎儿的物质交换和信号传递，最终导致妊娠失败［22］。

DNA 甲基化是一种研究广泛且可稳定遗传的表观遗传修饰，是基因组印记建立和维持过程中重要的分子机制［23-24］。DNA 甲基化主要发生在富含CpG 二核苷酸的区域，该区域又称之为CpG岛。CpG 岛通常位于基因的启动子、第一个外显子以及第一个内含子区域。CpG 岛是印记基因的重要标记［25-26］。印记基因通常在CpG 岛区域形成差异甲基化区（DMRs）来调控其表达［27-28］。有研究表明，在人DSCAM基因内含子1 上存在1 个DMR 区，该DMR 区在母源等位基因上表现为重甲基化，调控该基因的印记状态［20］。本研究中采用亚硫酸盐测序法发现牛DSCAM基因启动子区和第一个外显子区域含有1 个CpG 岛，在DSCAM基因印记的胎盘中，该区域中存在1 个DMR 区，表明DNA 甲基化可能参与调控了牛DSCAM基因的胎盘特异性印记的发生。

DSCAM基因在牛中为父源印记基因，DSCAM基因启动子区和第一个外显子处的DMR 调控该基因在胎盘的特异性印记，可为深入探讨牛DSCAM基因的功能和印记相关的分子机制提供参考依据。