高效液相色谱-串联质谱法检测鸡肌肉中尼卡巴嗪、地克珠利和托曲珠利的主要代谢物残留量

◎宋佳盛，李 彤，李胜南，刘贵铭，牛莹莹，刘凤海

（牡丹江医学院 公共卫生学院，黑龙江 牡丹江 157011）

尼卡巴嗪属于二硝基类抗球虫药，是4,4-二硝基均二苯脲（DNC）和α-羟基-4,6-二甲基嘧啶（HDP）复合物，主要用于预防鸡柔嫩艾美耳球虫和堆型、巨型、毒害、布氏艾美耳球虫，尼卡巴嗪进入动物体内HDP排泄迅速，DNC排泄缓慢起主要抗球虫作用[1]。地克珠利和托曲珠利是均三嗪类的高效、广谱、的抗球虫药，可有效预防和治疗鸡、兔、羊和猪等禽畜艾美耳寄生虫病。其中，地克珠利进入动物体内不易分解，主要以原体抑虫，而托曲珠利在动物体内可快速磺化成为妥曲珠利砜，起到抗球虫作用。二硝基类和均三嗪类抗球虫药具有较强的治疗效果，但由于其半衰期较短，频繁用药导致食品中药物代谢物残留增加影响食品安全，危害人体健康。欧盟和中国均颁布食品安全标准，对鸡肌肉、皮和脂肪及肝、肾中这3种抗球虫药物代谢物最大残留限量做了明确的规定[2]。因此，使用时应严格按照用法用量，并遵守停药期，以避免食品中超标残留。

抗球虫药代谢物残留量的检测方法有免疫法[3]、液相法[4]、液质联用法[5]法，其中，免疫分析法往往需要制作相应复杂的抗体，存在准确率不高等缺点。液相色谱法仪器操作简单，可以同时检测多种抗球虫药物，但灵敏度仅能达到1 ug/kg。液相色谱-串联质谱法是国家标准检测方法中推荐的首选方法，灵敏度高可达1 ng/kg，检出限低，完全能够满足实际需要[6]。实验采集不同地区鸡肌肉样品，选用液相色谱-串联质谱法对样品中尼卡巴嗪、地克珠利、托曲珠利的代谢物残留量分析，结果令人满意。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

尼卡巴嗪（4,4-二硝基均二苯脲）、地克珠利、托曲珠利砜（北京TMstandard科技股份有限公司）、乙腈、甲醇，其余所用试剂均为分析纯，水为超纯水，现用现制。

AB SCIEX 4500型三重四极杆质谱仪（AB SCIEX公司 美国）；UltiMate3000型高效液相色谱仪（Thermo公司 美国）；204E型电子天平（METTLER TOLEDO公司 德国）；QC10260超声清洗仪（天津旗美公司）；4型涡旋混合器（IKA公司 德国）；3-18型高速冷冻离心机（Sigma公司 德国）；PureLab Classic超纯水器（ELGA公司 英国）。

1.2 标准溶液配制

1.2.1 标准储备液

称取尼卡巴嗪（以4,4二硝基均二苯脲计）、地克珠利、托曲珠利、托曲珠利砜标准品约10 mg（精确至0.1 mg，按纯度值折算）。用甲醇溶解并定容至10 mL，标准储备溶液质量铱度为1 000 mg/L。-20 ℃以下避光贮存，保存期为12个月。

1.2.2 标准中间液

分别准确量取100 μL尼卡巴嗪（4,4二硝基均二苯脲）、地克珠利、托曲珠利、托曲珠利砜标准储备液，用甲醇稀释至10 ml ，质量浓度为10 mg/L的标准中间液，-20 ℃避光保存，180 d内有效。

1.2.3 内标标准使用液Ⅰ

分别准确量取100 μL托曲珠利-d3溶液，用甲醇稀释为10 mL,质量浓度为1 mg/L的标准中间液，-20 ℃避光保存，180 d内有效。

1.2.4 内标标准使用液Ⅱ

准确内标标准使用液Ⅰ1 mL ，用乙腈定容至10 mL，标准使用液质量浓度为0.1 mg/L，4 ℃贮存，保存期为30 d。

1.2.5 标准使用液

配制系列标准溶液，目标化合物浓度分别为0.2 μg/L、0.5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L 和100 μg/L，内标浓度为5 μg/L。

1.3 试样制备

选取200 g用均质器混合均匀，-4 ℃以下保存备用。称取均质试样2.00 g，置于50 mL聚丙烯离心管中，准确加入50 uL内标标准使用液Ⅰ，加入2 mL水涡旋混匀，再加入10 mL乙腈，旋涡混合30 s超声提取20 min。10 000 r/min离心10 min（-5 ℃)。在15 mL离心管内加入250 mg DSC-18和2 g无水硫酸钠，再加上述上清6 mL，转速9 000 r/min 离心时间5 min，最后取上清液1 mL用于HPLCMS/MS测定。

1.4 仪器工作条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱Kinetex F5 C18（Phenomenex 美国），50 mmx3 mm、2.6 μm；柱温设置20 ℃；进样量5 μL；流动相：A 水，B 乙腈。液相色谱梯度洗脱条件表见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱条件表

1.4.2 质谱条件

电喷雾离子源：离子源温度为500 ℃；毛细管电压为5.5 kV；脱溶剂气温度为550 ℃；脱溶剂气流量为40 psi ；扫描模式：多离子反应监测模式（MRM )。其它质谱参数表见表2。

表2 目标化合物的质谱分析参数表

2 结果

2.1 提取过程的优化

2.1.1 选取提取溶剂

选择正己烷、乙腈、三氯甲烷、二甲基亚砜和丙酮等5种有机溶剂对鸡肉和鸡蛋中地克珠利进行提取，发现提取效率分别为98.4%、80.9%、76.3%、69.6%、57.7%。因此，选择乙腈作为提取溶剂。

2.1.2 提取温度的选择

选择5、0、-5 ℃低温冷冻条件下样品提取，提取效率分别为99.2%、97.4%和92.3%，选择-5 ℃作为提取温度。

2.2 色谱条件优化

2.2.1 流动相的选择

使用甲醇-水和乙腈-水2种流动相，对托曲珠利和内标物进行分离。由图1可以看到，使用乙腈-水作为流动相时，目标物的信号强度更高，干扰信号更低。因此，选择乙腈-水作为最佳流动相。

图1 乙腈-水位流动相时托曲珠利和内标物的色谱图

2.2.2 流动相组成比例的影响

对比流动相乙腈-水中乙腈比例分别为60%、80%、100%时分离效果，发现乙腈比例增大，目标色谱峰出峰变快，响应信号强。见图2。

图2 流动相中不同比例乙腈-水对保留时间的影响结果图

2.2.3 流速的影响

为了研究流速对分离效果的影响，比较了300、350、400 μL/min 3种不同流速下的实验结果。实验表明，在流速降低时，保留时间延长，峰高和峰面积增加，分离效果更好。因此，选择了300 μL/min作为最佳流速。

2.2.4 柱温的影响

在20、30、40 ℃三种不同的柱温下，对50 mg/L的尼卡巴嗪标准溶液进行了分离。结果显示，在温度升高的情况下，峰面积没有明显变化，但是出峰时间具有显著差异。在30 ℃和40 ℃时，尼卡巴嗪的出峰时间都比20 ℃时快很多。因此，选择了30 ℃作为最佳柱温。

2.3 质谱条件优化

将浓度均为100 μg/L尼卡巴嗪、地克珠利、托曲珠利、托曲珠利砜标准品直接进样，通过碰撞能量、去簇电压等条件优化，建立质谱参数。尼卡巴嗪选择136和107作为定量和定性离子，地克珠利选择333和222.9作为定量和定性离子，托曲珠利砜选择399和147.8作为定量和定性离子，托曲珠利母离子不易形成碎片，分子离子选择424.2。

2.4 标准曲线、检出限和定量限

以目标组分峰面积与内标的峰面积之比为纵轴，标准工作液的质量浓度ρ（μg/L）为横轴，绘出标准曲线，见表3。

表3 3种抗球虫药主要代谢物残留量的标准曲线、检出限和定量限表

2.5 精密度和准确度

对地产鸡肉、鸡蛋样品进行采样后进行精密度、回收率实验。称取鸡肉或鸡蛋 200 g，按上述制样方法制取待测溶液6份，计算出相对标准偏差（RSD）并对精密度评价。结果如下：尼卡巴嗪RSD为2.04%，回收率87.5%~109%；地克珠利RSD为1.93%，回收率95.7%~107%；托曲珠利RSD为1.39%，回收率97.2%~106%；托曲珠利砜RSD为1.63%，回收率92.6%~101%。

2.6 实际样品分析

在黑龙江省6个城市采集鸡肉66份、鸡蛋66份，使用该方法检测其中抗球虫类药物，结果发现，鸡肉和鸡蛋样品中尼卡巴嗪、地克珠利含量均＜0.1 μg/L，托曲珠利、托曲珠利砜均＜1.0 μg/L，表明，黑龙江省的鸡肉和鸡蛋中3种抗球虫药物的食品风险很低。

3 结语

通过对黑龙江省部分城市的鸡肉和鸡蛋样品中抗球虫类药物残留量的检测，结果样品中均未检出，符合国家标准食品中兽药最大残留限量的要求。在优化实验条件和性能评价后，超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法可对鸡肉和鸡蛋中3种抗球虫药残留量进行有效测定，方法灵敏、准确、可靠，可以作为食品中尼卡巴嗪、地克珠利、托曲珠利和托曲珠利砜的检测方法。