ctDNA的研究现状及在肺癌诊疗中的研究进展

夏瑶 司毛燕 朱慎钰 饶鼎宇 谢春发 李树林 唐志贤

【摘要】 肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在大多数国家均居首位。肺癌的早期诊断、早期治疗是提高治愈率的关键。新兴的液体活检技术中，血液中循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA， ctDNA）的检测在肺癌的研究与应用已进行了广泛研究。近年来ctDNA液体活检技术的高速发展给肺癌的诊断及治疗带来了新的突破，有望成为肺癌诊断、指导治疗及监测复发等多方面的新途径。本文对目前ctDNA的研究进行了总结，并讨论ctDNA检测在肺癌筛查、治疗及复发等方面的应用前景。

【关键词】 ctDNA 肺癌 液体活检 生物标志物

[Abstract] Lung cancer is one of the most common malignant tumors， and its morbidity and mortality rank first in most countries. Early diagnosis and early treatment of lung cancer are the keys to improving the cure rate. Among the emerging liquid biopsy techniques， the detection and application of circulating tumor DNA （ctDNA） in blood has been extensively studied in the research and application of lung cancer. In recent years， the rapid development of ctDNA liquid biopsy technology has brought new breakthroughs in the diagnosis and treatment of lung cancer， and is expected to become a new way of lung cancer diagnosis， treatment guidance， and monitoring of recurrence. This article summarizes the current research on ctDNA， and discusses the application prospect of ctDNA detection in lung cancer screening， treatment and recurrence.

[Key words] ctDNA Lung cancer Liquid biopsy Biomarkers

First-author's address： Gannan Medical University， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.14.043

肺癌是最常见的恶性肿瘤，同时也是癌症死亡的主要原因，2018年预计新增肺癌病例210万例，死亡180万例，占癌症死亡人数的近1/5[1]。肺癌大致分为非小细胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung lancer，SCLC）兩大类，其中非小细胞肺癌占80%～85%[2]。我国肺癌的发病率也呈整体上升趋势，是近30年来发病率增长最快的恶性肿瘤。由于肺癌在早期没有明显的临床症状，大多数患者就诊时已是中晚期，仅有少数患者有机会接受手术治疗。虽然肺癌的5年生存率极低，仅有9%～20%，但早期肺癌5年生存率可高达70%左右[3-4]。因此，肺癌的早诊早治尤为重要。当前胸部CT、穿刺活检等诊断方法对患者的健康会有影响且自身具有一定的局限性。应用在肺癌临床检测的传统分子生物学标志物有数十种，其中CEA、CA19-9、NSE、CYFRA21-1和CA125通常用于临床上肺癌的辅助诊断及疗效的评估。但是其敏感度和特异度均比较低[5]。

液体活检是一种利用DNA检测技术获取血液中肿瘤有关线索的无创检测技术。由于循环肿瘤DNA（ctDNA）是从血浆中提取的，因此这种所谓的液体活检是一种非侵入性的体外诊断技术，为难以接近的实体瘤精准监测提供了可能性。如今ctDNA已成为一类新的肿瘤标志物，大量研究充分证明ctDNA在肺癌的应用上是一个极具前景的生物标记物。

1 ctDNA的本质及检测方法

1.1 ctDNA的本质 ctDNA是短的DNA片段，主要存在于血液中，可提供来自多个肿瘤区域肿瘤细胞脱落的生物标记物[6]。故ctDNA可定义为肿瘤细胞脱落进入体循环的短DNA序列。与其他血液标记物相比，ctDNA水平反映了活动性肿瘤细胞死亡的速度，是一种更好的生物标记物，可以“实时”反映治疗后的肿瘤负担，有更好的即时监测能力[7]。ctDNA检测为明确患者的基因组及相关信息提供了新途径。血浆中的ctDNA作为一种高度特异性的非侵入性生物标志物，它也正在成为癌症早期筛查[8]、预测治疗反应及评估复发的标志物[9-10]。

1.2 ctDNA的检测方法 当前对ctDNA进行定量或定性的检测手段很多。数字聚合酶链式反应（PCR）于1999年推出，涉及稀释DNA，可以扩增单个模板分子并单独测序，从而检测稀有突变体[11]。该技术后来被修改，称为BEAMing法，它利用磁珠结合单个DNA分子，这些DNA分子已在PCR成分的微乳液中被扩增[12]。新一代测序和大规模并行测序进一步改进了ctDNA样本中的突变检测[13]。还有一种称为CAPP-Seq（通过深度测序的癌症个性化分析）的技术已运用来进行ctDNA检测[14]。此外，全外显子组测序（韦斯）已经应用于ctDNA检测[15]。可喜的是已有罗氏血液ctDNA突变高通量测序试剂盒获批用于ⅢB～Ⅳ期非小细胞肺癌辅助诊断。总的来说，目前ctDNA的检测方法有流式细胞术、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、二代测序（next-generation sequencing，NGS）等[16-17]。如今，随着基于纳米技术的生物传感器等新技术不断出现和应用，为肺癌ctDNA检测带来了新启发和方向[18]。

2 ctDNA检测的影响因素

ctDNA检测受多种因素的影响，Abbosh等[19]研究发现ctDNA检测与组织学亚型相关：97%肺鳞状细胞癌、19%肺腺癌及71%其他非小细胞癌亚型患者ctDN检测为阳性。在94%的Ⅰ期肺鳞状细胞癌中检测到ctDNA，但在Ⅰ期肺腺癌中仅检测到13%。该研究还表明早期非小细胞肺癌用ctDNA 检测进行筛查，其敏感度会受到肿瘤大小的限制，即肿瘤大小会影响ctDNA检测结果。

此外肺癌的不同分期，是否发生转移或坏死均直接影响血液中ctDNA的浓度。ctDNA的检测能力还因癌症类型及分期而异，其中小细胞癌（91.1%）、前列腺癌（87.9%）、子宫颈癌（77.6%）和肝癌（77.1%）。与其他癌症类型相比，肺癌显示出更高的敏感度。甲状腺癌（41.8%）和肾癌（56.4%）的ctDNA检测率更低。在分期上，Ⅰ～Ⅲ期癌症中检测ctDNA的敏感度>60%，在Ⅳ期疾病中，除肾癌和黑色素瘤外，大多数癌症类型的样本中检测到的ctDNA均超过70%[20]。综上，ctDNA检测受癌症类型、组织学亚型、分期、解剖位置和代谢活性及是否发生坏死和转移等多因素影响[21]。除肿瘤本身以外的其他因素也会产生影响，如，检测方法、检测面板、检测敏感度、患者性别及年龄等因素也会影响到ctDNA检测结果。此外，可检测的ctDNA水平不仅受肿瘤负荷的影响，还受肿瘤基因型的影响[22-23]。这些影响因素的发现对ctDNA检测应用于肺癌具有重要意义。

3 ctDNA检测在肺癌诊疗中的应用

3.1 ctDNA检测与肿瘤筛查 由于肿瘤细胞将自己的DNA释放到血浆中，因此ctDNA中突变或其他基因组改变的证据存在于血液中。所以通过“ctDNA液体活检”可以提供一种标志检测肿瘤的存在。正是这种“证据”的存在才能通过ctDNA检测对肺癌进行筛查和早期发现。与目前最流行的辅助诊断方法相比，现有蛋白质生物标志物的应用（例如癌抗原125、甲胎蛋白、癌胚抗原和癌抗原19-9等）通常仅限于一种或几种癌症类型，且特异度及敏感度较差[5，24]。

虽然ctDNA检测对局部或区域疾病的敏感度為57.9%[25]。尽管这不是特别理想，但已远远优于常见蛋白质生物标志物的敏感度。ctDNA在健康对照个体中的特异度大于95%[20]，也进一步证实使用ctDNA检测进行肺癌筛查和早期检测的可行性。Bettegowda等[26]通过比较54例胃癌患者和59例年龄相匹配的健康者血浆中ctDNA的信息发现患者组血浆ctDNA平均水平比对照组高2.4倍，同样表明ctDNA水平可用于癌症筛查。虽然在早期肺癌中ctDNA的检测有一定的局限性，但ctDNA分析技术的快速发展暗示了该领域很快能发展出用更低的阈值以更高的准确性检测ctDNA的能力。

3.2 ctDNA检测与肿瘤治疗 肺癌和大多数实体癌一样，评估治疗反应主要依赖于放射学，因此会受到宏观疾病成像分辨率的限制，尤其是对早期实体癌。且放射学不具有识别分子残留病灶（molecular residual disease，MRD）和隐匿转移的能力。而这正是ctDNA检测的优势，包括检测隐匿性癌症和追踪肿瘤特异性突变的潜在能力[27]。

Tie等[28]在一项研究中探索了ctDNA水平的早期变化作为评估治疗效果的标志物。在此项研究中52例患者中的48例患者无细胞血浆DNA中检测到（一致性为92.3%）ctDNA。在大部分未接受过治疗的转移性结直肠癌患者中可检测到ctDNA，一线化疗期间ctDNA的早期变化可预测后期放射学反应。提示了ctDNA可能是一种早期标志物，可用于癌症的治疗反应。在另外一项关于结肠癌的研究中，已证明在Ⅲ期结肠癌患者中ctDNA是术后有用的预后标志物，可以指导初始辅助治疗。化疗后的ctDNA状态与手术后的疾病状态有极强的相关性，能为额外的治疗提供信息[29]。因此，对于那些可以检测ctDNA水平，但在辅助化疗后没有放射学证据证明的癌症患者，可通过行ctDNA检测提早发现并治疗可以根除的残留病灶，增加治愈的机会。

在一项关于乳腺癌的研究中，分析了来自49例患者的208份血液样本，在完成辅助化疗后行长达4年的纵向监测[30]。值得注意的是，对于复发的患者，在临床复发前2年便能检测到分子复发，敏感度为89%，特异度为100%。明确了个性化ctDNA检测具有比目前的临床检测方法（如CA15-3）更加有效的监测能力，能为额外的治疗干预提供一个关键的机会窗口。另一研究表明，在ctDNA分析的指导下，疾病控制率高达85.7%[31]。一项基于单独定制的面板（ICP）的ctDNA测序的研究中发现，ctDNA的早期改变可预测非小细胞肺癌治疗期间的肿瘤负荷变化，特别是对于肿瘤负荷下降50%的患者，在放射学证实的疾病控制之前便能检测到ctDNA反应。此外，ctDNA载量下降幅度与肿瘤缩小呈正相关这种方法在临床应用时再结合个性化的管理策略，将提高免疫治疗对局部晚期非小细胞肺癌的临床益处[26，32]。

3.3 ctDNA检测与肿瘤预后及复发 ctDNA检测是一种无创、特异度强、敏感度高的肿瘤转移复发监测方法。在一项回顾性研究中，Reinert等[33]在36个月的随访期间收集11例结直肠癌患者的151个系列血浆样品，已接受了针对其Ⅰ～Ⅳ期疾病的预期手术治疗。其中6例患者经历了疾病复发，5例没有，期间随访检测和定量ctDNA水平的变化，在非复发患者的术后血浆样本中未检测到ctDNA，而在复发患者的术后血浆样本中均检测到ctDNA，产生100%的敏感度和100%的特异度。这项研究显示了ctDNA分析对肿瘤复发的高敏感度和强特异度。此研究还发现，行ctDNA检测平均比影像学等常规随访早7、8个月检测到复发。在肺癌中比影像平均提前时间4个月[19]。

在一項关于乳腺癌转移复发前循环肿瘤DNA的个性化检测中，18例复发患者中16例在临床或影像学复发前检测到血浆ctDNA（敏感度89%），预测转移性复发的提前期可达2年。在156份血浆样本中，31例非复发患者在任何时间点均未出现ctDNA阳性（特异度为100%）[34]。另一项关于早期乳腺癌分子复发检测的评估研究中，23例患者中有22例（96%）通过ctDNA检测到远处颅外转移复发，再次表明ctDNA检测的高度敏感度[35]。随着对乳腺癌、结肠癌、肺癌等研究的不断深入和成果的不断累积，肿瘤患者术后复发与ctDNA之间的相关性证据也愈加完善[36]。在未来，它极有可能成为个性化和优化肺癌患者术后临床管理的有效检测工具。

3.4 ctDNA检测在SCLC中的应用 SCLC占肺癌的15%～20%，其生物学行为恶劣，易转移，易耐药，易复发及预后差。早诊、早治和早期预后评估对小细胞肺癌患者的治疗和延长其生存期至关重要。小细胞肺癌患者很少在复发时进行活检，获得的组织不足以进行分子检测。但由于小细胞肺癌具有早期血行播散的特点，使得ctDNA测序在小细胞肺癌中成为一种有前途的基因组分析方法[37]。

Devarakonda等[38]检测了近600例小细胞肺癌患者的ctDNA谱，通过ctDNA测试，去识别DNA修复，MAPK和PI3K途径及MYC和ARID1A等基因的潜在靶向改变。研究结果表明，在一个扩展的基因面板上进行ctDNA检测有可能提高对小细胞肺癌治疗耐药机制的认识，并有助于开发新的治疗策略并指导临床治疗。

ctDNA检测与传统通过手术切除早期小细胞肺癌样本、异种移植物或细胞系进行测序的研究不同，对小细胞肺癌患者的ctDNA行进一步研究可有助于加速发现和开发对抗这种无情疾病的新药[38-39]。在另一项研究中，采集22例小细胞肺癌患者血浆样本中的430个癌症基因进行了靶向深度测序，分析数据表明ctDNA测序有助于描述小细胞肺癌的基因组格局、亚克隆结构和基因组进化[40]。此外小细胞肺癌ctDNA检测与其他癌症类型相比显示出极高的敏感度（91.1%）[20]，为小细胞肺癌的早期筛查、诊断提供新手段。

4 小结与展望

综上所述，肺癌是一种常见的恶性肿瘤，其死亡率在全国范围内位居第一[41]。血浆中的ctDNA是一种高度特异性的非侵入性生物标志物，其检测拥有快捷、方便、微创及能够对肿瘤进展实时跟踪等特点。在检测方法不断完善的今天，已开展的大量研究充分证明ctDNA是一个极具前景的生物学指标物。

但也要意识到当前ctDNA检测在肺癌这一癌种的应用中还处于前期研究证据的不断累积过程中，对ctDNA的研究方法相差甚远，研究成果及结论之间互通困难，整体还处于探索阶段。还存在诊断特异性不高、价格昂贵、检测时间长等方面的不足。但随着我们对肿瘤发生、发展机制的认识越来越深入，检测技术的敏感度和特异度的不断提高，外周血ctDNA检测有望成为未来研究和临床应用的重要方向。因此，有理由相信ctDNA作为一种非侵入性肿瘤生物标志物，在肺癌早期筛查、治疗及复发等方面具有良好的应用前景。

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（收稿日期：2022-10-18） （本文编辑：田婧）