正交试验法优选通脉胶囊提取工艺

王 璐,付玉琪,孙永慧

(黑龙江中医药大学 中医药研究院, 哈尔滨 150040)

通脉胶囊是由黄芪、威灵仙、党参、水蛭、土茯苓、益母草等9味中药组合而成的复方制剂. 具有益气、活血、祛湿、通络的功效,用于下肢深静脉血栓形成后遗症、静脉炎、淤积性皮炎、淤积性溃疡、大隐静脉曲张等静脉疾病的治疗. 黄芪作为该方君药,具有补气升阳,益肾活血等功效[1-2]. 黄芪中的主要活性成分黄芪甲苷,具有抗细胞凋亡、降血糖、保护组织器官、调节机体免疫和抗炎抗病毒等多方面的药理作用[3-7],其测定多采用高效液相色谱法[8-11]. 为保障治疗效果,本文利用正交试验法优化通脉胶囊的提取工艺,以提取液中含黄芪甲苷的量和出膏率作为检测指标,采用HPLC-ELSD法测定制剂中含黄芪甲苷的量,作为评价提取工艺的标准.

1 仪器与试剂

1.1 仪器

高效液相色谱仪(Thermo Ultimate 3000型,赛默飞世尔科技公司);蒸发光散射检测器(ELSD-6000型,美国奥泰克科技有限公司).

1.2 药材与试剂

2 实验方法与结果

2.1 正交试验设计

经过文献检索[12-15]及筛选一定因素后,最后选定加水量(A)、提取时间(B)、提取次数(C)三个因素为考察因素,每因素各选取三个水平,以提取液中含黄芪甲苷的量和出膏率为指标,进行L9(34)水平的正交试验.提取工艺因素水平见表1.

表1 提取工艺因素水平表Table 1 Factor level table of extraction process

2.2 黄芪甲苷的含量测定[16]

2.2.1 色谱条件

Diamonsil C18色谱柱(内径4.6 mm,柱长25 cm,粒度5 μm);采用水 ∶乙腈(68 ∶32)为流动相;流速:1.0 mL/min;蒸发光散射检测器检测条件:空气气体流速2.5 L/min,漂移管温度105 ℃.

2.2.2 黄芪甲苷对照品溶液的制备

精密称取黄芪甲苷对照品适量,加80%甲醇定容至5 mL容量瓶中,制成质量浓度为0.495 8 mg/mL的对照品溶液.

2.2.3 供试品溶液的制备

分别取9次提取液的1/10至250 mL圆底烧瓶中,置水浴锅上加热蒸干,向其中加入80%甲醇溶液(含4%浓氨试液),称定其总质量,加热回流1 h,取出圆底烧瓶,冷却至室温,再称定质量,用含4%浓氨试液的80%甲醇溶液补足减失质量,摇匀,滤过,滤液置蒸发皿中蒸干,残渣用80%甲醇分次溶解至5 mL容量瓶中,加80%甲醇定容至刻度,摇匀,经0.45 μm微孔滤膜过滤后,即得供试品溶液.

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2.2.4 黄芪阴性对照溶液的制备

按处方量称取除黄芪外的其他药材,按供试品溶液的制备方法制成黄芪的阴性对照溶液. 按“2.2.1”项下的色谱条件分别吸取黄芪甲苷对照品、供试品和黄芪阴性对照溶液进样,结果表明黄芪阴性对照溶液在与黄芪甲苷对照品溶液相同的色谱峰位置处无干扰,见图1～3.

图1 黄芪甲苷对照品溶液HPLC图Figure 1 HPLC diagram of the Astragaloside A reference solution

图2 供试品溶液HPLC图Figure 2 HPLC diagram of the test solution

图3 阴性溶液HPLC图Figure 3 HPLC diagram of the negative solution

2.2.5 线性关系的考察

精密吸取上述对照品溶液1、2、4、6、8、10 μL,注入液相色谱仪,测定黄芪甲苷的峰面积. 以峰面积的自然对数值为纵坐标(Y),以对照品溶液进样量的自然对数值为横坐标(X),绘制标准曲线,得到标准曲线方程为:Y=1.344 3X﹢2.615 6(R2=0.999 4),表明黄芪甲苷的进样量在0.495 8～4.958 μg的范围内具有良好的线性.

2.2.6 精密度试验

精密吸取4 μL黄芪甲苷对照品溶液,按上述的色谱条件连续进样6次,计算出黄芪甲苷峰面积的RSD为0.94%,表明该仪器的精密度良好.

2.2.7 稳定性考察

精密吸取正交试验中的6号样品溶液,分别于0、2、4、6、8、10、12 h,按“2.2.1”项下的色谱条件进样25 μL,测得黄芪甲苷的峰面积,计算其峰面积的RSD为1.31%,表明该供试品溶液在12 h内稳定.

2.2.8 重复性试验

取6份正交试验中的6号样品溶液,按“2.2.3”项下的供试品溶液的制备方法制备,按上述的色谱条件吸取25 μL进样,测得黄芪甲苷的峰面积,计算其含量的RSD为1.34%,表明该方法重复性良好.

2.2.9 加样回收率试验

精密吸取6份6号样品的总提取液,每份为总提取液的1/20,分别精密加入质量浓度为0.495 8 mg/mL的黄芪甲苷对照品溶液0.25 mL. 按“2.2.3”项下的供试品溶液的制备方法得到待测溶液,按“2.2.1”项下的色谱条件分别进样25 μL,测得黄芪甲苷的峰面积,计算回收率,见表2.

表2 加样回收率试验及结果表Table 2 Experimental results of sample addition recovery

结果表明该方法用来测定提取液中含黄芪甲苷的量合理可行,准确度好.

2.3 试验结果

依次精密吸取正交试验表中的供试品溶液,按“2.2.1”项下的色谱条件分别进样25 μL,测得黄芪甲苷的峰面积,外标两点法计算出正交试验表中9次提取液中含黄芪甲苷的量及出膏率. 综合测评=(含黄芪甲苷的量/含黄芪甲苷的量最大值)×70%+(出膏率/出膏率最大值)×30%,试验结果见表3,方差分析见表4.

表3 正交试验设计与结果Table 3 Orthogonal test design and results

表4 提取工艺方差分析表Table 4 Analysis of variance of extraction process

2.4 结果分析

由表3可以看出,各因素对通脉胶囊水提工艺作用主次为A>B>C,最佳工艺组合为A3B3C3,其中因素C(提取次数),C2和C3的K值相差不大;表4结果表明,因素A(加水量)对试验结果具有显著影响(P<0.05),而B、C两因素无显著影响. 综合直观分析与方差分析的结果,同时考虑经济、节能、省时等因素,确定最佳工艺组合为12倍量水,煎煮2次,第一次2 h,第二次1.5 h.

2.5 提取工艺验证试验

按照处方量称取药材,采用最佳提取条件进行提取,重复3次实验,求得提取液中含黄芪甲苷的量及出膏率,发现结果与正交试验的结果基本相同,表明该工艺可行.

3 讨 论

本复方制剂以水为溶剂采用传统煎煮法提取,黄芪中的主要活性成分黄芪甲苷,具有强心、抗炎抗病毒、调节免疫等作用,故选为本研究的主要考察指标;出膏率可以反映出全方的整体提取效果,亦可作为一个考察指标.

对样品的前处理还有用D101大孔树脂吸附和正丁醇萃取的方法,这两个方法步骤繁琐,同时导致检测到的提取液中含黄芪甲苷的量降低,因此本实验选用含浓氨水的甲醇溶液回流提取,方法更简便,色谱峰无干扰,也减少了黄芪甲苷的损失.

本实验选取提取液中含黄芪甲苷的量和出膏率作为检测指标,采用L9(34)正交试验法优化并筛选了通脉胶囊的最佳提取工艺,最终确定最佳提取工艺为12倍量水,煎煮2次,第一次2 h,第二次1.5 h,该工艺稳定可行,重复性好,为该制剂的生产及应用提供了理论依据.