柴胡治疗胃食管反流病作用的网络药理学研究

郭者相,娄玉婕,屈银宗

(1.湖北中医药大学 第一临床学院,武汉 430065;2.湖北中医药大学附属新华医院,武汉 430065)

胃食管反流病( gastroesophageal reflux disease,下简称GERD)是一种常见的消化系统疾病,近年来,随着人们生活水平的提高,其发病率有所上升[1],该病的临床表现多为烧心和反流,同时可伴有上腹胀,嗳气,胸痛以及咽部不适感等症状[2].本病起病较为隐匿,临床伴随症状多,在治疗上多以抑酸护胃为主,但是长期服用质子泵抑制剂(proton pump inhibitors,PPIs)类药物,患者依从性低,同时常伴有不良反应[3-4].在临床上,GERD的长期反复发作,不但严重影响患者的生活质量,对心理也造成负担,容易发展为焦虑抑郁[5].

祖国医学根据GERD的临床症状,将其归于“吞酸”“食管瘅”“嘈杂”等病症范畴[6],《四明心法·吞酸》有云:“凡为吞酸,尽属肝木,曲直作酸也.......若非木气,即寒即热即饱即拂郁亦不酸,以酸为木气也.”在中医藏象学说中,肝的生理特性为喜条达而恶抑郁,其主要生理功能之一是主疏泄,《血证论·脏腑病机论》中则进一步表述为:“木之性主于疏泄,食气入胃,全赖肝木之气以疏泄之……设肝之清阳不升,则不能疏泄水谷.”如果情志失调,或忧思焦虑,或恼怒抑郁,导致肝失疏泄,肝气横逆犯胃,胃失和降,进而出现反酸、呃逆、嗳气以及胁肋胀痛等一系列症状.故GERD发病核心病机之一在于肝失疏泄,治疗上当调畅气机.临床上常用柴胡、香附等疏肝理气,党中勤[7]在运用柴胡时同时佐以玫瑰花等芳香解郁之品,调肝理气,疏其气机以达常.

柴胡为伞形科植物柴胡或狭叶柴胡的干燥根,性味辛、苦、微寒,归肝、胆经,有和解表里,疏肝升阳之功效,可用于治疗胁肋胀痛,胸胁苦满,口苦等症.但对于柴胡治疗GERD的机制报道甚少,本研究运用网络药理学的方法分析柴胡治疗GERD的作用机制,从而为临床应用提供相关理论依据.

1 材料与方法

1.1 筛选柴胡有效成分及作用靶点

在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库,以“柴胡”为关键词进行检索,设置口服生物利用度( oral bioavailability,OB)值≥30% 、药物类药性 ( drug likeness,DL) 值≥0. 18,获得柴胡的成分.然后在“Related Targets”界面获取有效成分的作用靶点,通过Uniport数据库将靶点转换为基因名.

1.2 疾病相关基因的获取

在GeneCards数据库输入检索关键词“Gastroesophageal Reflux Disease”,检索并获取GERD的相关靶点.

1.3 药物有效成分-靶点相互作用的网络构建

将柴胡的有效成分和作用靶点导入Cytoscape3.9.1软件,进行可视化分析,得到有效成分-靶点相互作用网络图.

1.4 构建蛋白质互作网络(PPI)并进行可视化分析

将获取到的柴胡作用靶点和GERD的靶点取交集,绘制出Venn图,并将交集靶点上传至String数据库,选择蛋白物种“Homo sapiens(智人)”,设置“highest confidence(0.900)”,并隐藏网络中断开的节点,得到结果,即为蛋白质相互作用网络.将结果导入Cytoscape3.9.1软件,利用CytoNCA插件计算出度中心性(degreecentrality, DC)、特征向量中心性(eigenvectorcentrality, EC)、局部边连通性(localaverage connectivity, LAC)、中介中心性(betweenness centrality, BC)、接近中心性(closenesscentrality, CC)、网络中心性(network centrality, NC)值,数值越高,说明该节点在 PPI 网络中越处于核心地位,然后根据各种参数的中位值进行筛选,最终得到 PPI 网络的核心基因.

1.5 关键靶点基因本体论(GO)功能富集分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

利用DAVID数据库,将柴胡和GERD的交集靶点输入后,选择“OFFICAL-GENE-SYMBOL”和“H.sapiens”进行GO和KEGG通路富集分析,其中GO分析包括生物过程(Biological Process,BP),细胞组成(Cellular Component,CC)以及分子功能(Molecular Function,MF),得到数据结果后,利用微生信网站在线绘制GO功能与KEGG富集分析图.

2 实验结果

2.1 柴胡的活性成分

在TCMSP数据库检索柴胡,得到有效成分350个,经过筛选后符合条件的化合物成分共17个,主要成分有乙酸亚油醇酯(Linoleyl acetate),黄芩苷(Baicalin),豆甾醇(Stigmasterol),异鼠李素(isorhamnetin),山奈酚(kaempferol),3,5,6,7-四甲氧基 -2-(3,4,5-三甲氧基苯基)色酮(3,5,6,7-tetramethoxy-2-(3,4,5-trimethoxyphenyl)chromone),茵陈黄酮(Areapillin),荜澄茄素(Cubebin),长尾龙素A(Longikaurin A),羟基羽扇豆烷宁(Octalupine),赛因呋喃(Sainfuran),曲克芦丁(Troxerutin),右旋白花前胡乙素((+)-Anomalin),柴胡皂苷(saikosaponinc_qt),菠甾醇(α-spinasterol),矮牵牛素(petunidin),槲皮素(quercetin)等(表1).

表1 柴胡的活性成分Table 1 Active compounds of Chaihu

2.2 药物-疾病靶点

在GeneCards数据库检索得到5 123个靶点,其中Relevance score数值越高,表明该靶点与疾病关系越密切,对这些靶点进行三次中位数筛选.最终得到Relevance score≥18.6的640个靶点,利用韦恩图取药物、疾病靶点交集后,得到交集靶点60个(图1).

图1 柴胡治疗胃食管反流病的交集靶点Figure 1 Intersectional targets of Chaihu in the treatment of GERD

2.3 柴胡有效成分-靶点相互作用网络

利用Cytoscape3.9.1软件绘制出柴胡的有效成分治疗GERD的“有效成分-靶点”图,根据各节点度的高低进行排名并赋色,度值越大节点也越大,颜色也越深,得到下图(见图2).结果显示,排名靠前的槲皮素,山奈酚,异鼠李素是柴胡治疗胃食管反流病的关键成分.

2.4 PPI网络的构建

将交集靶点基因输入STRING网站,得到相互作用网络后,将其导入至Cytoscape3.9.1软件,利用CytoNCA插件,得到各种参数,然后根据每种参数的中位值进行筛选,最终筛选后取DC>5,EC>0.100026635,LAC>2.5,BC>15.518734,CC>0.4017094,NC>3.333333,结果显示共有11个中心节点,核心靶基因分别为AKT1,TP53,IL-10,APK1,ESR1,EGFR,VEGFA,STAT1,HIF1A,IL-1B,IL-2(见图3).

图3 蛋白相互作用网络图Figure 3 PPI network

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

通过GO分析,共得到534个条目,根据校正P值,P<0.05表示具有统计学意义,筛选后得到428个,分别选取在BP,CC,MF中排名前十的条目进行气泡图展示(图4).根据图示结果可以看出,柴胡主要参与基因表达的正向调控,细胞凋亡过程的负调节,RNA聚合酶ll启动子转录的正向调节,转录的正向调节DNA模板化,信号转导,细胞增殖的正向调节,对药物的反应,凋亡过程的正向调节,炎症反应,血管生成等生物过程和蛋白质结合,同一蛋白结合,酶结合,蛋白质同二聚化活性,蛋白激酶结合,细胞因子活性,锌离子结合,泛素蛋白连接酶结合,大分子复合物结合,血红素结合等分子功能.

图4 GO功能富集分析柴胡治疗胃食管反流病的关键靶点Figure 4 GO enrichment analysis of key targets of Chaihu in the treatment of GERD

通过KEGG分析,共得到129条通路,同样根据校正P值进行筛选后得到117条,选取排名前20的通路进行气泡图展示(图5).结果显示,柴胡治疗胃食管反流病主要涉及癌症的通路,脂质和动脉粥样硬化,糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路,癌症中的蛋白聚糖,Pl3K-Akt信号通路,卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染,人巨细胞病毒感染,HIF-1信号通路,癌症中的微核糖核酸,MAPK信号通路,结核,前列腺癌,人瘤病毒感染,化学致癌受体活化,膀胱癌,TNF信号通路,IL-17信号通路,丙型肝炎,恰加斯病等信号通路.

图5 KEGG通路富集分析柴胡治疗胃食管反流病的关键靶点Figure 5 KEGG pathway enrichment analysis on key targets of Chaihu in the treatment of GERD

3 讨 论

胃-食管发生反流是由于抗反流的防御机制下降以及反流通道的清除能力减弱,当下食管括约肌(lower esophageal sphincter,LES)不能承受胃和食管之间的压力差时,反流物沿着反流通道上行刺激咽喉,气道甚至耳鼻口腔,进而损伤上消化道和气道,长期反复的刺激,导致咽部异物感,烧心,口苦等不适[8].因此GERD合并精神和心理问题的比例较高,同时精神心理因素又会加重GERD的症状,进而降低患者的生活质量[9],Mustafa MelihBilgi等人的研究显示,GERD患者在抑郁方面的得分显著高于健康对照组[10].本文运用网络药理学的方法对柴胡治疗胃食管反流病的作用机制进行研究,通过分析柴胡的有效成分-靶点发现,柴胡的有效成分主要是槲皮素,山奈酚,异鼠李素和豆甾醇等.其中,槲皮素,山奈酚以及异鼠李素均属于黄酮醇类,现代研究表明,黄酮类化合物通过抑制NF-κB信号通路来调控巨噬细胞的抗炎活性抑制机制,许多参与炎症反应的介质如IL-1B,COX-2酶等都在转录水平上受到NF-κB的调控[11].另外,Anthony TaghoghoEduviere[12]等人的一项针对小鼠睡眠剥夺引起的焦虑和抑郁行为的研究显示,槲皮素能减轻抗氧化酶的损伤,并减少小鼠的焦虑抑郁行为.豆甾醇能够抑制COX-2酶和一氧化氮合酶( iNOS) mRNA,进而抑制前列腺素E2(PGE2)和一氧化氮NO的释放[13],高浓度的一氧化氮能通过影响免疫和炎症反应而产生细胞毒性作用,胃食管交界处的上皮表面就处于高浓度一氧化氮环境下,因此胃食管交界处是胃食管反流发生的最主要部位[8].低浓度的一氧化氮能够松弛平滑肌,使得下食管括约肌功能降低,胃内容物更容易发生反流[14].通过PPI网络分析,柴胡治疗胃食管反流病的关键靶点为TP53,MAPK1,EGFR,HIF1A,AKT1,ESR1,STAT1以及VEGFA和炎症调控因子IL-10等.Takehide Fukuchi[15]等人的一项回顾性研究发现,在接受了内镜下黏膜下层剥离术(endoscopic submucosal dissection,ESD)治疗食管鳞状细胞癌的极低风险组患者中,其主要临床表现为胃食管反流,同时发现肿瘤的致癌潜能(TP53突变)相对较高.MAPK级联反应包括细胞外信号调节激酶(ERK),c-Jun N端激酶(JNK)和p38激酶,A·Chwiesko[16]等在研究中发现,长期的胃食管反流症状可能导致ERK和p38的激活,导致食管鳞状上皮发生了分子层面的变化,进而发展为巴雷特食管(barrett’s esophagus,BE).杨克利[17]等人在一项研究中发现,在胃食管反流病患者胃液中均检测到不同浓度的胆汁酸,而Ken-ichiMukaisho[18]等人的研究证实,胆汁酸可以通过EGFR或NF-κB途径驱动促炎细胞因子的表达,另外一项研究已发现GERD患者的EGFR表达水平低于巴雷特食管或食管腺癌患者,表明EGFR的表达与胃食管反流病的进展具有直接相关性[19].在人类中,雌激素受体(ERα)是由基因ESR1编码,Jacqueline-Yvonne Cephus[20]等人的研究证实ERα信号增加IL-33释放和ILC2介导的炎症,Jing Shan等人研究发现IL-33能够加重反流性食管炎的炎症,STAT1的抑制剂可以完全阻断干扰素γ(IFNγ)对IL-33的诱导,降低IL-33的释放,进而减轻炎症[21-22].JustynaWasielica-Berger[23]等人在对不同类型的GERD患者进行研究后发现,其VEGF水平较对照组明显升高,而VEGFA的表达已被研究发现和炎症呈高度正相关[24-25].

根据GO分析结果,柴胡治疗胃食管反流病的作用机制主要集中于参与基因表达的正向调控,信号转导,炎症反应,血管生成等过程,表明柴胡可能通过调控炎症通路,促进血管新生来改善胃食管反流症状.KEGG的分析结果显示柴胡治疗胃食管反流病的途径主要包括癌症途径,Pl3K-Akt信号通路,HIF-1信号通路,MAPK信号通路,膀胱癌,TNF信号通路,IL-17信号通路,丙型肝炎等信号通路.胃食管反流发生时,胆汁酸和HIF-1相互作用导致HIF-1信号通路中断,促进了感染或维持了慢性感染,从而进一步促进胃食管反流[26],而局部的缺氧环境使得HIF-1激活VEGF修复血管,加速新生.食管上皮细胞受到酸的刺激,产生各种炎性细胞因子如IL6,IL8等,在IL-1和TNF-α等促炎细胞因子的刺激下,NF-κB通路被激活,产生炎症.食管在酸暴露的情况下,显著增强了食管微血管内皮细胞中Akt和MAPKs的磷酸化,导致粘膜鳞状上皮屏障紊乱[27],PI3K-AKT通路激活后,IκBα被IκB激酶(IKK)磷酸化,并被泛素介导的蛋白水解降解,促进了NF-κB p65的磷酸化,进一步激活炎症因子的表达[28].基于此,可以推测柴胡具有一定的抗氧化作用,能够有效清除活性氧,降低iNOS水平,防止促炎物质如一氧化氮和TNF-α的合成,抑制NF-κB的磷酸化进而减少促炎因子的表达,减轻胃食管反流病的炎症反应,降低HIF-1的水平,抑制AKT信号通路的磷酸化.另一方面也提示,在治疗胃食管反流病时,可以考虑从抗氧化,抑制炎症反应以及改善患者情绪入手,而不仅仅停留于抑制胃酸分泌,保护胃黏膜方面.

综上所述,本文运用网络药理学的方法,预测柴胡治疗胃食管反流病的作用机制,发现可能是通过槲皮素,山奈酚,异鼠李素,豆甾醇等有效成分,作用于TP53,MAPK1,EGFR,HIF1A,AKT1,VEGFA等靶点,调节Pl3K-Akt信号通路,HIF-1信号通路,MAPK信号通路,TNF信号通路等途径,发挥其抗氧化,抑制炎症反应,阻止癌变等作用.但本研究在一定程度上缺乏有效数据支撑,后期应进行相应的体外实验和临床试验加以验证.