浙贝母给药后大鼠尿液、粪便的预处理及稳定性

王 昊,宗 政,胡玲玲,王金宏,胡 扬*,程 斌

(1.哈尔滨商业大学 药学院, 哈尔滨 150076;2.浙江药科职业大学 中药学院,浙江 宁波 315100)

中药浙贝母为百合科浙贝母(FritillariathunbergiiMiq.)的干燥鳞茎,为我国浙江省传统道地药材之一[1].现代研究表明其具有抗溃疡、止咳祛痰平喘、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗癌抗肿瘤等药理作用[2-8].其临床应用范围广泛,用药历史悠久,常用于哮喘、胃病、肺癌等多种疾病[9-11].

近年来关于浙贝母药效物质基础的研究愈发普遍,而对其体内代谢过程的研究变得尤为重要.为减少尿液、粪便样品中内源性杂质干扰,富集更多的药源性成分,对大鼠灌胃浙贝母后的尿液、粪便样品预处理方法进行筛选特别重要[12-13].为了揭示浙贝母在体内代谢等过程,常常要采集给药后的大鼠的尿液、粪便样品,而这些样品的稳定性有待考察;有时在研究时往往需要进行大批量取样,样品存储条件对样品稳定性的影响,直接关系到实验结果是否准确[14].本文采用UPLC-Q-TOF-MS技术建立了不同的预处理方法的含药和空白尿液与粪便图谱,对尿液样品的5种预处理方法和粪便样品的4种预处理方法进行筛选,并对尿液和粪便样品经预处理和未经预处理冻存0、3、5、7、10、15 d后的稳定性进行考察.以期为后续尿液与粪便中的成分分析及体内代谢研究奠定基础.

1 实验材料

1.1 仪器

Xevo G2 Q TOF质谱(美国Waters公司);Acquity UPLC色谱仪(美国Waters公司);台式离心机(上海安亭科学仪器厂);分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);干式氮吹仪(北京成萌伟业科技有限公司);快速混匀器(常州国华电器有限公司).

1.2 药材与试剂

浙贝母药材(产地:浙江章水),购自药材市场;SPE小柱(ProElut PLS60mg/3 mL)) 购自北京迪马科技有限公司;乙腈(质谱级)、甲醇(质谱级)均购自Fisher Scientific(美国)有限公司;甲酸(质谱级)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;甲醇(色谱级)、正丁醇(分析纯)、乙酸乙酯(分析纯)购自天力化学试剂有限公司;三氯甲烷(分析纯)购自科密欧化学试剂有限公司;屈臣氏蒸馏水(广州屈臣氏食品有限公司).

1.3 动物

Wistar 雄性大鼠(230±20) g,购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司,批号:SCXK(吉)-2018-007.饲养条件:自由进食饮水,适应性饲养一周,动物室室温(22± 1) ℃,湿度45%～60%.

2 方法与结果

2.1 灌胃溶液的制备

称取浙贝母样品粉末13 g过4号筛,加入26 mL的浓氨水溶液浸润1 h,然后加入 260 mL的三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合液,于80 ℃水浴中加热回流提取2 h,自然放冷,过滤后浓缩成浸膏,-20 ℃冰箱保存.

2.2 给药方案以及样品收集

将雄性大鼠分为2组(空白组、给药组)每组6只.浙贝母给药剂量为0.9 g·kg-1·d-1(以生药计),空白组给予等体积生理盐水,每日1次,连续给药7 d.

尿液粪便样品收集:末次给药后将大鼠置于代谢笼中,禁食12 h不禁水,收集0～12 h 含药尿液、粪便.所得尿3 500 r·min-1条件下离心15 min,取上清液,放入-20 ℃冰箱中储存备用;同法操作得空白尿液.所得粪便放入-20 ℃冰箱中备用;同法操作得空白粪便.

2.3 色谱及质谱条件

色谱柱:Agilent ZORBAX HPLC Eclipse Plus C18(150 mm×3 mm,1.8 μm);柱温:30 ℃;流速:0.4 mL·min-1;进样量2 μL.流动相A:0.1%甲酸水,流动相B:乙腈,梯度洗脱程序如表 1 所示.

表1 流动相的梯度洗脱系统Table 1 Gradient elution systems for mobile phases

质谱系统:电喷雾离子源,V模式,电压:3.0 kV,离子源温度:100 ℃,去溶剂气温度:400 ℃.去溶剂气流速:800 L·h-1,锥孔气流速:50 L·h-1.选择正负离子扫描方式,扫描范围m/z50～1 200,碰撞能:20～45 mV.

2.4 尿液、粪便样品的预处理方法的筛选

2.4.1 SPE固相萃取法

取已解冻的尿液上清液2 mL,加入10倍量甲醇,涡旋2 min,以13 000 r·min-1离心10 min,取上清液N2吹干,加入蒸馏水定容到2 mL.活化SPE柱后,取尿液样品于SPE小柱中,加水3 mL冲洗,弃去洗脱液,加甲醇3 mL洗脱,收集甲醇洗脱液, N2吹干后用0.4 mL质谱甲醇超声复溶,经0.22 μm微孔滤膜过滤;同法制备空白尿液供试品,置于4 ℃待测.

将给药组粪便样品用研钵捣碎研磨,称取0.5 g,加入10倍体积甲醇,超声提取30 min,以13 000 r·min-1离心10 min,取上清液N2吹干,加水定容到2 mL,经0.45 μm微孔滤膜过滤;活化SPE柱后,取粪便样品于SPE小柱中,加水3 mL冲洗,弃去洗脱液,用3 mL甲醇洗脱,收集甲醇洗脱液,用0.4 mL质谱甲醇超声复溶,经0.22 μm微孔滤膜过滤;同法制备空白尿液供试品,置于4 ℃待测.

2.4.2 水饱和正丁醇萃取法

取已解冻的尿液上清液2 mL,加入2倍体积水饱和的正丁醇,涡旋2 min,萃取3次,水饱和正丁醇层经混合后N2吹干,用0.4 mL质谱甲醇超声复溶,经0.22 μm微孔滤膜过滤;同法制备空白尿液供试品,置于4 ℃待测.

将给药组粪便样品用研钵捣碎研磨,称取0.5 g,加10倍体积水超声提取30 min,以13 000 r·min-1离心10 min,取上清液N2吹干,用4 mL水溶解,加入2倍体积水饱和正丁醇萃取2次,取水饱和正丁醇层N2中吹干,用0.4 mL质谱甲醇超声复溶,经0.22 μm微孔滤膜过滤;同法制备空白尿液供试品,置于4 ℃待测.

2.4.3 乙酸乙酯液液萃取法

取已解冻的尿液上清液2 mL,加入2倍体积的乙酸乙酯,涡旋2 min,萃取3次,将乙酸乙酯层混合后N2吹干,用0.4 mL质谱甲醇超声复溶,经0.22 μm微孔滤膜过滤;同法制备空白尿液供试品,置于4 ℃待测.

将给药组粪便样品用研钵捣碎研磨,称取0.5 g,加10倍体积水超声提取30 min,以13 000 r· min-1离心10 min,取上清液用N2吹干,用4 mL水溶解,加入2倍体积乙酸乙酯萃取2次,取乙酸乙酯层N2吹干,用0.4 mL质谱甲醇超声复溶,经0.22 μm微孔滤膜过滤;同法制备空白尿液供试品,置于4 ℃待测.

2.4.4 乙腈沉淀蛋白法

取已解冻的尿液上清液2 mL,加入3倍体积的乙腈,涡旋2 min,以13 000 r·min-1离心10 min,取上清液N2吹干,用0.4 mL质谱甲醇超声复溶,经0.22 μm微孔滤膜过滤;同法制备空白尿液供试品,置于4 ℃待测.

将给药组粪便样品用研钵捣碎研磨,称取0.5 g,加10倍量乙腈超声提取30 min,以13 000 r· min-1离心10 min,取上清液用N2吹干后,用4 mL水溶解,加入2倍体积乙腈,以14 000 r· min-1离心5 min,取上清液N2吹干,然后用0.4 mL质谱甲醇超声复溶,经0.22 μm微孔滤膜过滤;同法制备空白尿液供试品,置于4 ℃待测.

2.4.5 甲醇沉淀蛋白法

取已解冻的尿液上清液2 mL,加入3倍体积的甲醇,涡旋10 min,以13 000 r·min-1离心10 min,取上清液N2吹干,用0.4 mL质谱甲醇超声复溶,经0.22 μm微孔滤膜过滤;同法制备空白尿液供试品,置于4 ℃待测.

2.5 尿液样品和粪便样品短期稳定性考察

将尿液样品与粪便样品按筛选确定的最佳方法进行预处理,N2吹干后,于-20 ℃下保存0(立即检测)、3、5、7、10、15 d后,于4 ℃缓慢解冻,用色谱甲醇充分溶解残留物,经0.22 μm微孔滤膜过滤,进行UPLC-Q-TOF-MS分析,通过计算各样本色谱峰的各峰相对峰面积的RSD值,考察经预处理后冻存尿液样品与粪便样品的稳定性.除将尿液样品与粪便样品不经预处理于-20 ℃下保存,保存后再按筛选确定的最佳方法进行预处理,其余操作与上述操作相同.

3 实验结果

3.1 尿液、粪便样品预处理结果

通过对5种不同预处理方法后的尿液样品在正、负离子模式下图谱分析,见图1.结果表明,尿液样品经乙腈萃取法处理后,含药尿液色谱图中的保留成分多,分离度较好,且引入的内源性成分较少,能够达到实验要求,适合作为本实验尿液的预处理方法.

图1 尿液样品预处理基峰色谱图Figure 1 Chromatogram of urine sample pretreatment base peak

通过对4种不同预处理方法后的粪便样品在正、负离子模式下图谱进行分析,见图2.结果表明:乙腈沉淀蛋白法处理粪便样品后,发现正负离子模式下的含药组保留成分数量多,分类效果好、响应值高,空白组引入的杂质及内源性成分也较少,能够达到实验要求,综合正负离子模式下的结果,乙腈沉淀蛋白法为粪便样品的最佳预处理方法.

图2 粪便样品预处理基峰色谱图Figure 2 Chromatogram of base peaks from pretreatment of fecal samples

3.2 尿液、粪便的稳定性考察结果

尿液、粪便样品经过乙腈沉淀蛋白法处理后的基峰色谱图见图3.其中尿液正离子模式下15号色谱峰(贝母素甲)和负离子模式下3号色谱峰(Coriolic acid);粪便正离子模式下17号色谱峰(贝母素甲代谢物M6)和负离子模式下13号色谱峰(Coriolic acid)峰面积、出峰时间相对适中,且稳定性、重现性最佳,因而尿液样品选择正离子15号峰和负离子3号峰为参照峰,粪便样品选择正离子17号峰和负离子13号峰为参照峰.经预处理和未经预处理后尿液、粪便样品在正负离子模式下各峰相对峰面积的RSD值见表2、3,结果表明乙腈沉淀蛋白法处理的尿液、粪便样品在15 d内稳定性良好.

图3 经预处理冻存的含药尿液、粪便样品基峰色谱图Figure 3 Chromatograms of base peaks from pretreated frozen medicated urine and feces samples

表2 尿液、粪便样品经过前处理后稳定性实验(相对峰面积)结果(n=6)Table 2 Stability experiment of urine and feces sample after pretreatment (Relative Peak Area) (n=6)

表3 尿液、粪便样品未经过前处理后稳定性实验(相对峰面积)结果(n=6)Table 3 Stability experiment of urine and feces sample without pretreatment (Relative Peak Area) (n=6)

4 讨 论

中药药效和毒副作用主要由药源性成分决定,由于体内生物样品存在基质复杂、内源性物质干扰严重、目标物质含量低等特点,使得药物体内成分分析以及相关代谢分析面临着严峻的挑战,因此对体内样品的前处理进行筛查尤为重要[15].当进行代谢组学或者其他相关研究时需要进行大规模取样,而取样后这些样品在储藏过程中药源成分以及含量是否发生变化均有待考察,这也直接关系到实验研究结果的准确性[14,16].

本文对大鼠给药浙贝母后的尿液、粪便样品预处理方法和短期冻存的稳定性进行了初步的考察.结果表明经前处理和未经前处理冻存15 d的含药尿液和粪便样品基峰色谱图的各峰相对峰面积的RSD值均小于20%,表明尿液粪便样品在15 d内稳定性良好.本实验为后续尿液与粪便中的成分分析及体内代谢研究奠定了基础.