KMT2C通过c-Myc/CDK4信号通路调控胃癌细胞的生长与增殖*

刘 浪, 邱 承, 陈思奇, 胡福清, 王桂华, 徐 丰

华中科技大学同济医学院附属同济医院胃肠外科,武汉 430030

赖氨酸特异性甲基转移酶2(lysine specific methyltransferase 2,KMT2)是一个具有组蛋白甲基转移酶活性的同源蛋白家族[1],在哺乳动物细胞中广泛表达。已有研究证实,KMT2家族蛋白通过组蛋白甲基化修饰影响染色质重塑,在多种肿瘤的进展中起到重要作用[2]。组蛋白的单甲基化、双甲基化、三甲基化以及去甲基化可动态调控染色质的结构与功能。KMT2家族蛋白主要包括SET1A、SET1B、KMT2A、KMT2B、KMT2C、KMT2D,其中KMT2C可与核心蛋白(WDR5、RBBP5、ASH2、UTX、PA1等)构成MLR(MLL-TRR)复合体,在基因启动子或增强子区域使H3组蛋白4位赖氨酸发生单甲基化(H3K4me1)[3]。

本文探究了KMT2C在胃癌细胞中的作用及其具体的分子机制,有望为今后新药的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

胃癌细胞系由本实验室前期保存并提供;RPMI-1640培养液、Opti-MEM无血清培养液、胎牛血清购于美国Gibco公司;Lipo3000转染试剂购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司;KMT2C、c-Myc、CDK4、H3K4me1抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司;GAPDH抗体购于武汉ABclonal生物科技有限公司;大肠埃希菌DH5α感受态、PCR试剂盒、 DNA凝胶回收试剂盒、基因组DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper),qPCR SYBR Green Master Mix(Low ROX Premixed)购于诺唯赞公司(中国);shRNA、PCR引物由奥科鼎盛(武汉)生物科技有限公司合成;CCK-8(cell counting kit-8)试剂购于美国MCE(MedChemExpress)公司;EdU检测试剂盒购于江苏碧云天生物公司;山羊抗鼠IgG绿色Dylight488荧光标记二抗、山羊抗兔IgG红色Cy3荧光标记二抗购于Abbkine公司(中国);染色质免疫共沉淀(ChIP)试剂盒购于武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2 TCGA数据库分析

在TCGA-STAD/RNAseq/STAR/TPM数据集中,对KMT2C在胃癌与癌旁之间的表达差异进行在线分析。

1.3 蛋白质免疫印迹法

提取处理后细胞的蛋白质,BCA法测定蛋白浓度,沸水加热10 min。恒压60 V下SDS-PAGE电泳,30 min后恒压120 V电泳1 h,转膜90 min,用5%脱脂牛奶室温封闭1 h,TBST清洗10 min,重复清洗3次。一抗4°C孵育过夜,取出膜,用TBST清洗10 min,重复3次,然后进行ECL化学显色。

1.4 细胞系构建

将质粒shNC、shKMT2C#1、shKMT2C#2分别与慢病毒包装质粒转染HEK-293T细胞,获得shNC、shKMT2C#1、shKMT2C#2慢病毒上清。向细胞系中加入病毒上清,获得稳定转染细胞系。

1.5 克隆形成实验

分别取shNC、shKMT2C#1、shKMT2C#2组对数生长期细胞消化后进行细胞计数,每组取400个细胞接种于6孔板,细胞贴壁后更换培养液,间隔3 d更换一次培养液,2周后终止培养;弃培养液,用PBS洗3次,4%多聚甲醛室温固定15 min;弃固定液,用1%结晶紫染色20 min,用ddH2O缓慢冲洗,待6孔板干燥后拍照计数细胞克隆。

1.6 CCK-8法检测胃癌细胞增殖

将shNC、shKMT2C#1、shKMT2C#2组对数生长期细胞消化后进行细胞计数,稀释后每组取3000个细胞接种于96孔板中,每组分别设3个复孔。细胞贴壁后更换培养液,加入CCK-8反应物,继续培养2 h后,450 nm波长下测定吸光度值(A450nm),按照相同方法分别于24、48、72、96 h后测吸光度值,绘制细胞生长曲线。

1.7 EdU(细胞DNA合成速率测定)检测

按照试剂盒相应步骤进行。将shNC、shKMT2C#1、shKMT2C#2组对数生长期细胞消化后进行细胞计数,稀释后每组取3000个细胞接种于96孔板中,每组分别设3个复孔。细胞贴壁后更换培养液,加入含EdU试剂的培养液,并在培养箱孵育2 h。取出96孔板,弃去培养液,配制EdU检测试剂,加入96孔板中并孵育30 min。使用DAPI进行细胞核染色10 min。于显微镜下观察并拍照。

1.8 构建皮下移植瘤模型

分别构建shNC、shKMT2C#1、shKMT2C#2稳转BGC-823胃癌细胞株,并接种于裸鼠皮下,观察皮下瘤生长情况。

1.9 基因集富集分析(GSEA)

在NCBI的GEO数据库中下载GSE54129,在GSEA软件中进行富集分析。

1.10 qRT-PCR检测

弃去细胞培养液,PBS清洗3遍,每107个细胞加入1 mL Trizol后,反复吹打裂解细胞。将Trizol裂解液转入1.5 mL EP管中,室温放置5 min。向1 mL的Trizol裂解液中加入0.2 mL氯仿,剧烈振荡15 s,室温下放置2 min。12000 r/min离心15 min。将上清与异丙醇按1∶1混匀,室温放置10 min,12000 r/min 4℃离心10 min。弃上清,加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀,12000 r/min 4℃离心10 min。弃上清,自然干燥,肉眼无明显残余上清后加入无酶水溶解。按照HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)说明书将提取的RNA逆转录为cDNA。按照qPCR SYBR Green Master Mix(Low ROX Premixed)说明书上机。

1.11 免疫荧光检测

将shNC、shKMT2C#1、shKMT2C#2组的细胞接种于12孔板爬片上,待细胞贴壁后,弃去培养液,PBS清洗2次,4%多聚甲醛固定20 min,用1%BSA室温封闭1 h,一抗以1∶200比例与1%BSA混匀后加入12孔板,覆盖爬片,4℃浸染过夜;次日,弃一抗,用1%BSA洗3次,荧光二抗(Abbkine)按1∶100与1%BSA混匀加入12孔板并浸没爬片,室温染色1 h;弃二抗,用1%BSA洗3次,DAPI染色5 min,取出爬片倒扣至预先滴有荧光淬灭剂的玻片上,置于湿盒封存待检。

1.12 ChIP检测

取shNC、shKMT2C#1、shKMT2C#2细胞各约(1～2)×107个细胞根据Proteintech公司ChIP试剂盒说明书行染色质免疫共沉淀实验。用甲醛将活细胞中的蛋白质和DNA交联在一起,裂解细胞后用酶切法进行DNA的片段化,添加一抗孵育,捕获抗体结合的蛋白DNA复合物并利用磁珠清洗,洗脱DNA,利用磁力架吸附磁珠,转移上清至新管。解交联、Proteinase K消化和DNA纯化,终止反应。纯化DNA用于后续实验。

1.13 统计学方法

所有实验重复3次。使用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析。数据均以均数±标准差表示,采用t检验比较各组间均数差异,以P<0.05为差异具有统计学意义。通过Kaplan-Meier生存曲线分析患者生存期差异。

2 结果

2.1 KMT2C在胃癌中高表达

利用TCGA数据库,分析了KMT2C在胃癌中的表达水平,结果示KMT2C表达水平在胃癌中显著增高(图1A)。于华中科技大学同济医院胃肠外科收集临床胃癌样本8例,提取样本分析KMT2C蛋白水平差异,可见在6例样本中KMT2C呈高表达(图1B)。Kaplan-Meier Plotter数据库在线分析KMT2C高表达组和KMT2C低表达组胃癌患者的生存期差异,结果示KMT2C高表达胃癌患者预后较差(图1C)。

A:TCGA数据库在线分析胃癌组织KMT2C mRNA表达量;B:Western blot检测胃癌组织与癌旁组织临床样本中KMT2C蛋白表达量,P为癌旁组织,T为胃癌组织;C:Kaplan-Meier分析不同KMT2C表达量的胃癌患者的生存期;*P<0.05图1 KMT2C在胃癌中的表达情况Fig.1 Expression of KMT2C in gastric cancer

2.2 敲减KMT2C体外抑制胃癌细胞增殖

在BGC-823细胞系中敲减KMT2C(图2A),Western blot验证敲减效率后行克隆形成、CCK-8、EdU检测,结果示敲减KMT2C后,BGC-823细胞克隆形成数明显减少(图2B);CCK-8结果显示敲减KMT2C后细胞活力降低(图2C);EdU检测结果显示敲减KMT2C后细胞DNA合成速率降低(图2D)。综上,敲减KMT2C可抑制胃癌BGC-823细胞系的增殖。

2.3 敲减KMT2C体内抑制胃癌细胞增殖

构建裸鼠皮下瘤模型,定期监测皮下瘤体积。注射后32日取皮下瘤。结果可见敲减KMT2C的胃癌细胞在体内的增殖能力降低(图3A)。敲减KMT2C的BGC-823细胞移植皮下瘤的体积及重量相较于对照组降低(图3B、3C)。综上,我们认为KMT2C在体内有促进胃癌细胞增殖的作用。

2.4 KMT2C促癌作用与c-Myc/CDK4通路相关

利用GSEA对GSE54129胃癌数据集进行KMT2C基因集富集分析,结果示KMT2C与c-Myc信号通路相关(图4A)。在BGC-823细胞中敲减KMT2C后检测c-Myc及其下游CDK4的mRNA水平和蛋白表达量,结果见敲减KMT2C后c-Myc的蛋白表达量无明显变化,CDK4的蛋白水平降低(图4B)。qRT-PCR检测各组KMT2Cc-MycCDK4的mRNA水平变化,结果示KMT2C敲减后c-Myc的mRNA水平无明显改变,CDK4的mRNA水平降低(图4C)。通过荧光定位分析发现敲低KMT2C后,核内c-Myc定位无明显变化(图4D)。故KMT2C不影响c-Myc表达水平及核内定位。

A:Western blot验证敲减效率;B:各组BGC-823细胞克隆形成;C:CCK-8法检测各组细胞增殖曲线;D:各组的EdU检测结果;**P<0.01图2 敲减KMT2C在体外抑制胃癌细胞BGC-823增殖Fig.2 Knockdown of KMT2C suppresses gastric cancer cells proliferation in vitro

A:各组裸鼠皮下瘤大小测量(n=6);B:皮下瘤生长曲线;C:各组皮下瘤重量;**P<0.01图3 敲减KMT2C在体内抑制胃癌细胞BGC-823增殖Fig.3 Knockdown of KMT2C suppresses gastric cancer cells proliferation in vivo

2.5 KMT2C与c-Myc结合促进CDK4转录

KMT2家族可与转录因子结合,并通过H3K4me1、H3K4me2以及H3K4me3改变核小体中组蛋白与DNA空间关系从而促进或抑制转录因子对下游基因的转录调控[4]。通过免疫共沉淀验证KMT2C可与c-Myc核内结合(图5A、5B)。提取胞核蛋白并检测敲低KMT2C后H3K4me1蛋白表达量,结果示敲减KMT2C后,H3K4me1降低(图5C)。JASPAR网站上查询c-Myc识别模序(图5D),预测CDK4的结合位点(图5E),ChIP结果可见敲低KMT2C后,c-Myc与CDK4的启动子结合减少(图5F、5G)。

A:KMT2C基因集富集分析结果示意图(NES=168,Nominal P-value=0.0);B:敲减KMT2C后BGC-823细胞中c-Myc、CDK4蛋白表达水平;C:敲低KMT2C后BGC-823细胞中c-Myc、CDK4 mRNA表达水平,**P<0.01;D:免疫荧光结果示意图,敲低KMT2C后c-Myc的核内定位无明显改变,标尺=10 μm图4 KMT2C功能与c-Myc信号通路相关Fig.4 KMT2C function is related to c-Myc signaling pathway

A:免疫共沉淀示KMT2C与c-Myc结合;B:免疫荧光共定位示KMT2C与c-Myc胞核内共定位,标尺=10 μm;C:KMT2C敲减后H3K4me1水平降低;D:c-Myc识别模序示意图;E:JASPAR预测c-Myc结合CDK4启动子结合位点结果;F:核酸凝胶电泳检测c-Myc与CDK4启动子结合减少;G:qRT-PCR检测c-Myc与CDK4启动子结合,**P<0.01图5 BGC-823细胞中KMT2C与c-Myc结合促进CDK4转录Fig.5 KMT2C binds to c-Myc to promote transcription of CDK4 in BGC-823 cells

3 讨论

胃癌是全球第5大最常见的癌症和第3大最常见的癌症死亡原因,作为一种分子和表型高度异质性的疾病,目前研究中的一项重要挑战是将胃癌发病机制的分子生物学新发现转化到有效的治疗中[5]。基因突变以及表观遗传修饰共同塑造了转录调控紊乱的肿瘤细胞[6],其中表观遗传修饰(包括DNA、组蛋白的各种修饰)在肿瘤的发生发展中发挥着不可忽视的作用。DNA紧密地包绕在组蛋白上共同形成核小体,是染色质的主要成分,组蛋白的翻译后修饰(甲基化、乙酰化、磷酸化等)可改变染色质结构,从而促进或抑制基因的转录[7]。KMT2家族(lysine methyltransferase 2 family)是一个编码组蛋白甲基转移酶蛋白的家族,KMT2家族蛋白甲基化组蛋白H3尾部的4位赖氨酸从而调节染色质结构[8]。已有文献报道KMT2C在胰腺导管腺癌[9]、前列腺癌[10]中的促癌作用。然而KMT2C在胃癌中的作用鲜有报道,其作用机制尚未完全阐明。

Myc-CDK4轴是Wnt信号通路的重要组成部分,是肿瘤中最容易发生异常的途径之一[11]。CDK4是c-Myc信号传导的重要下游介质,在细胞周期的G1/S期起着至关重要的作用。c-Myc在胃癌中的过度表达可由Wnt途径激活诱导,其表达又可增强CDK4的表达,从而促进癌细胞的增殖。目前尚未有KMT2C影响c-Myc/CDK4信号通路的相关报道。

本研究结合数据库及临床样本分析发现KMT2C在胃癌组织中高表达,通过GSEA富集分析发现KMT2C与c-Myc信号通路相关,进一步说明KMT2C与c-Myc结合,促进H3K4me1表达,发挥类似增强子的作用[11],增强CDK4转录,从而促进胃癌细胞的体内外增殖[12]。

我们的研究证明了KMT2C/c-Myc/CDK4信号通路在胃癌发生发展过程中的作用机制,为新药的研发提供了新的思路与理论依据。KMT2C有望成为胃癌的潜在治疗靶点[13],即通过小分子抑制剂改变组蛋白甲基化修饰状态从而治疗肿瘤[14]。同时,KMT2C有望成为胃癌的预后指标之一。