骨关节炎中自噬相关信号通路 *

秦庆庆 谢 犇 王一坤 阳庆林 王勇平

（1 兰州大学第一临床医学院，兰州 730000；2 兰州大学第一医院骨科，兰州 730000）

骨关节炎(osteoarthritis, OA)是一种慢性且高发的关节病，也是全世界疼痛和残疾的最常见原因，其发病特征为关节软骨变性、破坏、软骨下骨硬化或囊性变、滑膜增生等[1]。年龄、肥胖、遗传因素和关节损伤等多种风险因素为OA 的常见病因。软骨细胞是正常软骨中唯一的细胞类型，OA 的病理变化主要围绕软骨细胞的凋亡和功能障碍展开[2]。Cheng 等[3]研究发现，在OA 动物模型中，维持软骨细胞的自噬水平可预防软骨退变，是维持软骨细胞生存的重要方式。

自噬(autophagy)作为一种高度保守的降解系统，在调节能量和营养、维持体内能量代谢方面发挥着至关重要的作用。在外压、低营养、缺氧、内质网应激等异常生理条件下自噬对细胞发挥保护作用[1]。自噬的本质是细胞内的膜重排，其发生过程大体分为以下4 个阶段：自噬的起始、隔离膜和自噬体的形成、自噬体与溶酶体融合、自噬体的裂解。受损的细胞质大分子、膜和细胞器通过自噬途径被转运到溶酶体进行降解和再利用[4]。近年来许多国内外学者发现，自噬作为一种细胞内降解系统，维持细胞内能量代谢的稳定状态，已被证明可以恢复受损软骨细胞的功能，减轻OA 的发生和进展。但OA 与自噬更深一步的机制尚未完全明确，且目前临床仍缺乏行之有效的治疗方案。本文首次就自噬的信号通路在OA 方面的研究进展进行综述，以期为进一步探究自噬信号通路的内在调控机制，选择适当的干预靶点为靶向自噬治疗OA 提供新思路。

一、PI3K/Akt/mTOR 信号通路

PI3K 包括三类分子(I、II、III)，其中对各种生物活性有贡献的PI3K I 类是研究最多的。PI3K I 类是含有调节亚单位p85 和催化亚单位p110s 的异二聚体。蛋白激酶B (Akt)是PI3K 信号传导的重要信使。基于丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)残基的差异，Akt分为三种亚型（Akt1、Akt2 和Akt3）。Akt 的激活依赖两个磷酸化过程，即磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1 和2 分别在Thr308 处和Ser473 处磷酸化[5]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是Akt 的重要底物，并且mTOR 分子归属于PI3K 分子大家族，能够接受并且响应各种信号。目前研究表明PI3K/Akt/mTOR 信号通路是一条在自噬过程中抑制性的通路，活化后可以用来抑制自噬，保护细胞免受凋亡；反之，抑制该通路会诱发自噬并使细胞进入凋亡过程。

Xu 等[6]研究发现过表达沉默信息调节因子3(slience information regulator, SIRT3)可恢复IL-1β 诱导的自噬抑制；此外，IL-1β 诱导的PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活被SIRT3 过表达抑制，而SIRT3 敲除则增强；同时在大鼠OA 模型中过表达SIRT3 的关节损伤程度减轻。这说明SIRT3 通过PI3K/Akt/mTOR 通路调节软骨细胞自噬和凋亡改善OA，是一种重要的OA 病理生理保护剂。Cai 等[7]研究表明miR-27a 靶向PI3K 基因3'-UTR 使其沉默，与正常细胞和组织相比，OA 软骨和IL-1β 处理的关节软骨细胞中PI3K mRNA 水平下调，这说明miR-27a通过抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路促进IL-1β 处理的OA 软骨细胞自噬和凋亡，缓解OA 的进展。Shi等[8]研究发现与正常软骨组织相比，具有PHD 和RING 指域的类生物素1 (ubiquitin-like with PHD and RING finger domains 1, UHRF1)在人OA 软骨组织中的表达增加。IL-1β 是促进OA 软骨降解的主要炎症细胞因子，用于体外刺激人原代软骨细胞，而UHRF1 在IL-1β 诱导的软骨细胞中表达增强。此外，下调UHRF1 诱导IL-1β 处理后细胞增殖和自噬增加，软骨细胞凋亡减少。进一步研究表明，沉默UHRF1 减弱了IL-1β 处理后软骨细胞中PI3K/Akt/mTOR 信号通路的上调。然后，PI3K 激活剂减弱了沉默UHRF1 对IL-1β 诱导软骨细胞增殖、自噬和凋亡的影响，细胞自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对UHRF1 也有同样的影响。综上所述，抑制UHRF1可通过PI3K/Akt/mTOR 信号通路增强细胞自噬，保护OA 软骨细胞减少凋亡。研究表明续断总皂苷、淫羊藿苷、右归丸、β-蜕皮酮等药物可通过抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路激活软骨细胞自噬，从而缓解OA。总之，PI3K/Akt/mTOR 信号通路与OA 有着紧密的联系，通过抑制此通路激活软骨细胞的自噬，或成为治疗或缓解OA 的新策略。

二、AMPK 信号通路

在真核细胞中，AMP 活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是一种在结构和功能上高度保守的Thr/Ser 蛋白激酶，在调节细胞能量平衡中起主要作用。AMPK 感应细胞内腺嘌呤核苷酸水平的变化，当细胞内的AMP/ATP 比值增加时AMPK 激活，使能量的产生途径激活并且关闭能量的消耗途径来保存细胞内的能量[9]。除了在维持细胞内能量平衡中的作用外，AMPK 在细胞自噬中亦发挥着重要作用。

Lin 等[10]发现d-甘露糖通过促进5'AMP 激活AMPK 的磷酸化增强自噬的激活，延缓IL-1β 诱导的大鼠软骨细胞OA 的变性。研究表明，d-甘露糖具有软骨保护作用，并代表了对OA 的一种潜在治疗剂。Wang 等[11]建立小鼠OA 模型，在膝关节内注射二甲双胍，8 周后，发现二甲双胍恢复了手术诱导的关节软骨中MMP13 的上调和II 型胶原蛋白的下调。在培养的小鼠原代软骨细胞中，IL-1β 以剂量依赖性的方式加剧了细胞凋亡和分解代谢反应。在IL-1β 存在的情况下，二甲双胍增加了AMPKα的磷酸化水平，上调了SIRT1 蛋白表达，导致了自噬的增加、软骨细胞分解代谢和凋亡的减少。而灭活AMPKα 或抑制SIRT1 可抑制二甲双胍作用下的自噬增强。这表明在小鼠OA 模型中，二甲双胍通过激活AMPK/SIRT1 信号通路介导的自噬减轻软骨降解，减缓OA 的进展。Kong 等[12]建立小鼠OA模型，用苏木精-伊红染色发现活性维生素D (vitamin D, VD)可减轻小鼠OA 症状；Western Blot 结果亦表明，活性VD 处理可提高p-AMPK-AMPK 信号通路的活性，而降低p-mTOR-mTOR 信号通路的活性，增加了LC3II:LC3I 抗体比例和Beclin-1 蛋白表达水平，降低了p62 水平。而服用AMPK 抑制剂化合物C 和自噬抑制剂3-MA 逆转了活性VD 治疗后的这些变化。此外，转染mRFP-GFP-LC3 的结果表明，活性VD 导致OA 软骨细胞的自噬体聚集。这表明活性VD 通过介导AMPK-mTOR 信号通路激活软骨细胞自噬，减缓OA 的发生。此外，Duan 等[13]研究发现脂联素受体激动剂AdipoRon 通过激活AMPK-mTOR信号通路促进自噬，显著缓解OA 软骨细胞的钙化。Li 等[14]研究表明芒果苷通过激活AMPK 信号通路来增强软骨细胞的自噬，在小鼠OA 模型中有保护作用。大量研究表明，AMPK 信号通路与OA 有着密不可分的联系，可通过激活AMPK 信号通路增强软骨细胞的自噬，从而达到治疗或缓解OA 的目的。

三、MAPK/NF-κB 信号通路

丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) 是一种广泛存在于胞浆内的Thr/Ser蛋白激酶，在细胞增殖、分化、凋亡、存活等生理病理功能活动中具有重要作用。其下游分子NF-κB是一种核转录因子，是多种免疫转录程序的重要组成部分，参与机体炎症反应、免疫应答，调节细胞凋亡、应激反应等。Yao 等[15]发现从植物千金子中提取的头孢菌素 (cepharanthine, CEP) 通过抑制MAPK 和NF-κB 的 激 活，抑 制 了IL-1β 或TNF-α刺激下的基质金属蛋白酶 (MMPs)、具有血小板反应蛋白基序5 (ADAMTS5) 和诱导型一氧化氮合酶(iNOS) 的升高表达，并上调了聚集蛋白聚糖、胶原蛋白II 和Sox9 的蛋白质表达。此外，CEP 可以逆转IL-1β 或TNF-α 诱导的软骨细胞中细胞自噬水平的降低。在小鼠OA 模型中，与OA 组相比，CEP治疗组减轻了软骨退化并预防了OA。研究首次证明了CEP 能通过MAPK/NF-κB 通路逆转由IL-1β 或TNF-α 诱导的软骨细胞自噬水平的降低，从而减轻软骨退化和预防OA。You 等[16]发现在IL-1β 刺激莽草酸(shikimic acid, SA) 预处理的人软骨细胞可有效降低iNOS、Cox-2、MMPs 的表达，增加II 型胶原蛋白、ATG7、Beclin-1、LC3 的表达，以及增加自噬通量。从机制上，发现SA 抑制了IL-1β 诱导的MAPK 和NF-κB 通路的激活。此外，建立大鼠OA 模型，大鼠原代软骨细胞染色和大鼠OA 模型结果显示，SA 在体内可缓解OA 的进展。这表明SA 通过抑制MAPK/NF-κB 信号通路来激活软骨细胞的自噬，从而达到了改善OA 的目的。Yan 等[17]发现蛋白酶激活受体2 (protease-activated receptor 2,PAR2) 拮抗剂能显著改善OA大鼠体内的病理状况。PAR2 拮抗剂可以抑制炎症因子（TNF-α 和Cox-2）的产生，降低MMP-1 和MMP-13 的水平，抑制P62 蛋白水平，增加LC3-II 的表达。体外研究表明，PAR2 拮抗剂可促进IL-1β 诱导的软骨细胞增殖和集落形成。此外，PAR2拮抗剂可降低体外p-p38、p-IκBα和p-NF-κB 的表达，而PAR2 激动剂则表现出相反的作用。p38 MAPK 抑制剂亦可显著促进IL-1β 诱导的软骨细胞增殖，减轻TNF-α 和Cox-2 的产生，下调MMP-1 和MMP-13 的蛋白表达，降低IL-1β诱导的软骨细胞P62 的表达，增加LC3-II 的表达。同时，p38 MAPK 抑制剂可逆转PAR2 激动剂对IL-1β诱导的软骨细胞功能的影响。这表明下调PAR2 可通过调节MAPK/NF-κB 信号通路诱导自噬进而改善OA，PAR2 可能是治疗OA 的潜在候选药物。综上所述，MAPK/NF-κB 信号通路与OA 有着重要的关联，通过抑制此通路可激活软骨细胞的自噬，从而为治疗或缓解OA 提供新的方向。

四、ERK1/2 信号通路

胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinases, ERK)包括ERK1 和ERK2，参与细胞增殖与分化，是促分裂原活化的蛋白激酶信号转导通路的家族成员之一，刺激通过ERK 信号转导通路传至细胞核内，在软骨细胞的增殖和自噬方面起着关键性的作用。李晓东[18]研究发现姜黄素能够抑制IL-1β 诱导的软骨细胞凋亡；IL-1β 降低细胞活性具有剂量和时间依赖性，姜黄素能够抑制IL-1β 诱导的软骨细胞凋亡，抑制凋亡标志物caspase-3 的激活，促进Bcl-2 的表达。同时，姜黄素能够上调经IL-1β 处理软骨细胞的自噬水平，表现为软骨细胞内自噬小泡数量增加，软骨细胞内自噬分子标志物LC3-II、Beclin1 表达增加。此外，IL-1β 能够抑制软骨细胞内的ERK1/2 磷酸化作用和软骨细胞内LC3-II 和Beclin-1 的表达，而一定浓度的姜黄素可以增加软骨细胞内ERK1/2磷酸化程度和LC3-II、Beclin-1 的表达。这表明姜黄素能够通过激活ERK1/2 信号通路上调软骨细胞的自噬水平，从而抑制IL-1β 诱导的软骨细胞凋亡。Xu 等[19]从OA 病人中分离并培养的人原代软骨细胞，后分别用硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)单独或与不同剂量的当归多糖(angelica sinensis polysaccharide, ASP)联合治疗。检测细胞活力、凋亡情况和Bcl-2、Bax 等凋亡相关蛋白。通过轻链3(LC3) II 免疫荧光染色、mRFP-GFP-LC3 荧光定位和Western Blot (LC3II, p62, Beclin-1, Atg5)评价自噬水平；利用Western Blot 检测ERK1/2 通路的激活情况；采用自噬抑制剂3-MA、氯喹(chloroquine, CQ)和ERK1/2 特异性抑制剂验证ASP 的自噬作用。研究结果显示ASP 显著挽救了SNP 诱导的软骨细胞凋亡，而ASP 单独促进了软骨细胞增殖。这表明当归多糖通过ERK1/2 通路诱导OA 中软骨细胞的自噬，减轻了硝普钠诱导的OA 中软骨细胞凋亡，从而达到了缓解OA 的作用。ERK1/2 信号通路在软骨细胞自噬的研究尚处于初步探索阶段，就目前研究而言，激活ERK1/2 信号通路可促进软骨细胞自噬减少软骨细胞凋亡，为OA 的治疗提供了一个新的方向。

五、NF-κB 信号通路

NF-κB 是一种核转录因子，它可与某些基因启动子区固定的核苷酸序列结合，具有启动基因转录的功能，同时NF-κB 是体内调控细胞的增殖、分化、炎症过程中的重要转录因子，其能够参与机体的炎症反应、免疫应答及其他应激反应。刘志刚等[20]通过定量实时聚合酶链反应(RT-qPCR)检测OA 软骨细胞和正常软骨细胞中miR-140-5p 和MMP-13表达水平；将软骨细胞分为3 组，对照组加入IL-1β培养，miR-140-5p 模拟物组同时转染miR-140-5p mimic，miR-140-5p 抑制剂组同时转染miR-140-5p inhibitor。采用MTT 法检测各组软骨细胞增殖情况，采用RT-qPCR 和Western Blot 法检测各组MMP-13、Beclin-1、ATG7 和NF-κB 信号通路中NF-κBp65 表达情况。研究结果显示：OA 软骨细胞中miR-140-5p 相对表达水平较正常软骨细胞中显著降低，MMP-13相对表达水平较正常软骨细胞中显著增高。与对照组比较，miR-140-5p 模拟物组软骨细胞增殖明显，miR-140-5p 抑制剂组软骨细胞增殖明显受到抑制。与对照组比较，miR-140-5p 模拟物组软骨细胞中MMP-13、NF-κBp65 mRNA 和蛋白表达水平均明显降低，而miR-140-5p 抑制剂组均明显升高；miR-140-5p模拟物组软骨细胞中Beclin-1 和ATG7 mRNA 和蛋白表达水平均明显升高，而miR-140-5p 抑制剂组均明显降低。这表明miR-140-5p 能够通过抑制NF-κB信号通路促进OA 软骨细胞的增殖和自噬，延缓OA 的进展，为探索靶向miR-140-5p 治疗OA 提供了新思路。Feng 等[21]采用PCR、Western Blot 和免疫荧光染色方法检测细胞自噬相关生物标志物和凋亡分子，并通过MDC 染色和透射电镜检测细胞自噬水平；建立大鼠模型，观察雷公藤红素对大鼠软骨的保护作用，结果发现雷公藤红素可改善IL-1β诱导的软骨细胞凋亡，并增加LC3-II 和Beclin-1 的表达，而3-MA 抑制了雷公藤红素对软骨细胞的保护作用。此外，PDTC（NF-κB 通路抑制剂）可以促进软骨细胞自噬的激活，减少软骨细胞的凋亡。这表明雷公藤红素在体内外均可通过促进细胞自噬和抑制NF-κB 信号通路来抑制软骨细胞凋亡。NF-κB 既可作为上游分子激活软骨细胞的自噬，亦可作为其他信号通路的“转接站”发挥作用，减少了软骨细胞的凋亡，为治疗OA 提供新的靶向。

六、其他

除上述通路外，Zhang 等[22]研究发现姜黄素通过Akt/mTOR 信号通路诱导软骨细胞自噬，减少了软骨细胞的凋亡和破坏，从而减缓了OA 的进展；Fisher[23]研究表明白藜芦醇通过抑制Wnt/β-catenin信号通路可诱导软骨细胞自噬来缓解OA；Wang等[24]发现二甲双胍通过增强SIRT3/PINK1/Parkin信号通路抑制IL-1β 诱导的氧化和OA 样炎症，表明二甲双胍在预防和治疗OA 中起着重要的作用。Lu 等[25]研究发现成纤维细胞生长因子21 通过激活SIRT1-mTOR 信号通路上调自噬通量，保护软骨细胞免受凋亡、衰老和细胞外基质分解代谢的影响，减少了OA 的发生。

除信号通路外，大量研究表明OA 中自噬信号轴在OA 的发展、治疗和预防中亦起着不可替代的作用。本文将OA 中常见自噬相关信号轴做以下总结（见表1）。

表1 OA 中自噬相关信号轴

七、总结与展望

OA 是一种以软骨退化为主的退行性疾病，对于自噬与OA 方面相关信号通路的研究，就目前而言PI3K/Akt/mTOR 信号通路最为深入，通过调控这条通路来调控自噬，进而调控软骨细胞功能、代谢和凋亡。目前普遍认为自噬作为一种适应性反应可以减少OA早期的细胞死亡，但随着OA 的发展，过度的自噬也可能导致细胞死亡。因此，从自噬对细胞降解的程度来看，自噬既是细胞存活机制又是细胞死亡途径[1]。即便如此，我们认为通过信号通路激活自噬对于OA早期发展中软骨细胞的存活具有积极意义。各种信号通路并非完全相互独立，他们通过细胞因子、蛋白质等物质相互连接形成复杂的调控网络，尽管自噬相关信号通路在OA 发病机制中的作用尚未完全阐明，但自噬作为OA 的治疗靶点仍具有广阔的临床前景。通过靶向调控自噬相关信号通路调节软骨细胞自噬水平为临床治疗OA 提供了新的方向。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。