背根神经节和脊髓表皮生长因子受体在多种疼痛中的表达及作用差异*

徐 婷 田书心 甄思佳 吴茗慧 吕政仪 吴雨欣 沈赟涛 杜俊英房军帆 方剑乔,2 梁 宜,2Δ

（1 浙江中医药大学第三临床医学院针灸神经生物学实验室 浙江省针灸神经病学重点实验室，杭州 310053；2 浙江中医药大学附属第三医院针灸科，杭州 310005）

疼痛是一种与实际或潜在的组织损伤所产生相关的不愉快感觉以及情绪情感体验，或与此类似的经历[1]。主要类型可分为神经病理性疼痛、炎性痛和癌痛等。据统计，我国急慢性疼痛病人已超3 亿人，非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)、阿片类药物是目前临床常用镇痛药物，虽镇痛疗效显著但因其不良反应临床应用受限。表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor,EGFR) 广泛分布于神经系统，在许多实体肿瘤中存在EGFR 的异常表达，参与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制等[2]。近来研究报道，EGFR 除了介导癌性疼痛外，在炎性痛和神经病理性疼痛中也发挥了关键作用[3～5]。药理学研究已经证明鞘内注射EGFR 的特异性抑制剂AG1478 或者是EGFR 的siRNA (small interfering RNA, siRNA)/shRNA (short hairpin RNA, shRNA) 能够有效缓解机械性疼痛[3,6,7]。EGFR 在不同类型疼痛模型中表达和调控机制是否存在异同，尚未有报道。本文以EGFR 在疼痛中作用为出发点，对其干预疼痛的方式及在不同类型疼痛的作用特点进行阐述，探讨此受体介导不同类型疼痛的差异，以期为临床研发相关镇痛药物寻找潜在靶点。

一、EGFR 结构特点、功能及分布

EGFR 又称ErbB-1 或HER-1，属于ErbB (erbb receptor tyrosine kinase, ErbB)家族之一，具有酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)活性，通常以异源二聚体或同源二聚体形式存在，参与细胞的生长、增殖和分化等生理过程。ErbB 家族还包括ErbB2/HER2、ErbB3/HER3 和ErbB4/HER4 等成员，其中ErbB2 具有强酪氨酸激酶活性但缺乏配体结合，需与其他家族成员形成二聚化，以发挥配体有丝分裂及促肿瘤活性；ErbB3 酪氨酸激酶活性较低，通常需要与有强激酶活性的ErbB2 协同合作；EGFR 和ErbB4 均具备配体结合和胞内激酶活性，调控神经胶质细胞激活、炎性介质释放和中枢敏化等过程。

1.EGFR 结构特点和功能

EGFR 是一条由1186 个氨基酸组成的跨膜糖蛋白，包括一个含半胱氨酸的胞外域（促进配体结合）、一个具有酪氨酸激酶区的胞内域（激活域）和跨膜区域[8]。EGFR 配体结合和活化主要发生在胞外内，其主要结合配体为表皮生长因子 (epidermal growth factor, EGF)、β 细胞素蛋白、肝素结合EGF 生长因子 (heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor, HB-EGF)、神经调节蛋白-1 (neuregulin 1, NRG-1)等[9]。当EGFR 与配体结合发生二聚化后，诱导特定细胞内酪氨酸激酶残基的自磷酸化，进而引起下游信号级联反应的激活，包括细胞外信号调节激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinase 1 and 2, ERK1/2)、p38 丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases, MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B, AKT)、磷脂酶C-γ1 (phospholipase C gamma 1, PLCγ1) 和Janus 激 酶(Janus kinase, JAK)/信 号转导和转录激活 (signal trans-ducer of activators of transcription, STAT) 通路等驱动疼痛的超敏反应[10]。

在哺乳动物中，EGFR 不但可以促进胚胎植入和胎盘发育，并且参与多个器官的生长发育，包括肺、心、骨骼、肾、肝和大脑[11～13]。EGFR 对神经系统的发育至关重要，包括促进器官生长、分化、维持和修复，同时在中枢和外周神经系统中起到营养神经的作用，以此维持体内平衡[11,13]。EGFR 生理功能是调节上皮组织的发育发展；而在病理环境中，其主要在乳腺癌、脑癌、肺癌和胶质母细胞瘤中表达，故EGFR 的异常激活被视为肿瘤发生的驱动因素[2]。因EGFR 与配体结合激活细胞内信号级联反应，能有效刺激细胞增殖、存活和分化，目前常被作为是癌症治疗的重要手段。

2.EGFR 分布特性

EGFR 家族在神经系统中分布较为广泛。在外周神经系统中，皮肤神经、感觉小体、背根神经节(dorsal root ganglia, DRG)初级感觉神经元和施万细胞均有表达[4]。在DRG 神经元中，EGFR 能与肽能伤害感受器(calcitonin gene related peptide, CGRP)、非肽能伤害感受器(isolectin B4, IB4)和大直径的肽能神经元(neurofilament-200, NF200)的细胞共表达，但它与卫星胶质细胞(glial fibrillary acidic protein,GFAP)无共定位[14]。

在中枢神经系统中，EGFR 在大脑、脊髓背角均有表达。表达于小胶质细胞、少突胶质细胞和脑室下区(subventricular zone, SVZ)的祖细胞。值得注意的是，EGFR 在发育中的大脑神经元中大量表达，但在成人大脑神经元中明显减少[15～17]。EGFR 在脊髓广泛表达，高度集中在脊髓背角（脊髓I-IV）胶状质 (substantia gelatinosa, SG)。EGFR 与脊髓背角（脊髓I-IV）SG 中不同类型初级传入纤维均有共表达，包括无髓鞘肽能(calcitonin gene related peptide, CGRP)纤维、无髓鞘非肽能(isolectin B4, IB4)纤维和大直径有髓鞘(neurofilament-200, NF200)初级传入纤维。EGFR 在脊髓背角（脊髓I-IV）SG 的神经元和星形胶质细胞无表达，但与小胶质细胞共定位[14]。此外，Puig 等[14]和 Qu 等[18]分别在神经病理性疼痛模型、创伤性脊髓损伤模型(spinal cord injury, SCI) 中观察到EGFR 在脊髓背角（脊髓I-IV）在SG 中高表达，主要表达在小胶质细胞，在神经元或星形胶质细胞无表达。脊髓背角(spinal cord dorsal horn, SCDH)和DRG 作为疼痛传递的重要功能连接点，是本文探讨EGFR 在不同类型疼痛中作用差异的两个比较部位[14]。

二、EGFR 参与疼痛

1.激活EGFR 诱发疼痛

已有研究表明，在神经病理性疼痛、骨癌痛和炎性痛模型中，激活外周EGFR 可诱导机械异常和热痛觉过敏[3,19]。Mitchell 等[5]研究观察到神经损伤后EGFR 在患侧背根神经节明显上调，通过ErbB2 受体诱导形成二聚化，在驱动神经性疼痛超敏反应中发挥作用。另有研究报道，小鼠鞘内注射EGFR 特异性配体上皮调节蛋白(epiregulin,EREG)可增强甲醛诱导的伤害性行为反应，同时引起辣椒素诱导钙内流增强进而使疼痛超敏反应加剧[19]。现有研究证据提示，激活EGFR 可诱发痛觉过敏介导疼痛。

2.抑制EGFR 可镇痛

有研究表明[3]，鞘内注射EGFR 特异性受体抑制剂或反义寡核苷酸、EGFR 基因沉默等均可通过降低EGFR 表达或抑制其活性减缓机械痛觉过敏。Yang 等[20]报道实验大鼠鞘内注射EGFR 特异性抑制剂AG1478 后，可明显减轻骨癌痛大鼠诱发的机械痛觉过敏。另有研究报道鞘内注射EGFR siRNA，大鼠DRG 上的EGFR 蛋白表达明显降低，且大鼠患侧机械痛觉过敏减轻，缓解了大鼠的背根神经节慢性压迫 (chronic compression of dorsal root ganglion, CCD)模型的疼痛[3]。因此，通过抑制EGFR的活化可减轻实验大鼠痛觉过敏发挥镇痛效应。

三、EGFR 在不同类型疼痛中的角色差异

聚焦神经病理性疼痛、炎性痛和骨癌痛等疼痛模型，较全面检索现有研究结果，总结出EGFR 在不同类型疼痛中的表达差异及其可能作用机制（见表1）。

表1 不同类型疼痛模型动物背根神经节和脊髓的EGFR 表达情况

1.EGFR 与神经病理性疼痛

神经病理性疼痛(neuropathic pain, NP)是一类躯体感觉神经系统损伤或功能障碍引起的慢性疼痛，涉及神经细胞受体、酶、离子通道的复杂变化，主要表现为自发性疼痛、痛觉过敏和异常性疼痛等[21]。常见的神经病理性疼痛模型包括慢性背根神经节压迫模型、脊神经结扎 (spinal nerve ligation, SNL) 模型、坐骨神经损伤 (spared nerve injury, SNI) 和坐骨神经慢性结扎损伤(chronic constriction injury of the sciatic nerve, CCI) 模型等。

EGFR 在不同神经病理性疼痛模型中均有表达，其在外周DRG 神经元中普遍表达，而在脊髓中表达较少。研究报道，CCD 大鼠患侧L4～5DRG中p-/t-EGFR mRNA 表达上调约是空白组的2 倍，患侧DRG 中p-/t-EGFR 蛋白表达比值较空白组相比增加2 倍，而对侧较空白组该比值无变化；患侧脊髓背角EGFR 总蛋白及其磷酸化表达并无差异，健侧脊髓背角尚未研究[3]。SNL 大鼠造模后患侧L5DRG 中EGFR mRNA 水平显著高于假手术组约2.6倍[3]。SNI 小鼠造模后7 天患侧L3～L5背根神经节中EGFR 磷酸化明显上调，约为造模前的2 倍[19]。CCI 大鼠患侧DRG L4～L6中p-EGFR 明显上调，未观察到t-EGFR 变化[5]。采用EGFR 抑制剂吉非替尼 (Gefitinib)于SNL 大鼠L5鞘内注射，除显著抑制EGFR 蛋白表达外，还可有效缓解疼痛超敏反

应[14]；CCD 大鼠术后3 天连续4 天鞘内注射EGFR siRNA 可缓解机械性疼痛、热痛和冷痛[3]。CCI 大鼠鞘内注射EGFR 酪氨酸酶抑制剂可明显逆转神经损伤引起的反射性疼痛行为的超敏反应。以上研究结果提示，EGFR 表达在多种神经病理性疼痛模型中均显著升高，进而参与疼痛发生。

有研究表明，EGFR 活化后主要通过激活胞内MAPK、JAK/STAT、PI3K/AKT/mTOR (mechanistic target of rapamycin, mTOR) 等信号通路活化进而驱动疼痛超敏反应。Qu 等[18]观察到SCI 大鼠鞘内注射EGFR 阻断剂AG1478，可通过抑制EGFR/MAPK 级联反应来减少脊髓小胶质细胞中细胞因子的产生，进而减轻SCI 大鼠的背部组织水肿和改善后肢运动功能，缓解疼痛。Wang 等[3]报道采用鞘内注射EGFR siRNA 敲低CCD 大鼠L5DRG 中EGFR 表达时，可观察到mTOR 蛋白表达也同步下降，提示mTOR 可能是EGFR 介导CCD 大鼠伤害性行为的关键下游信号。

2.EGFR 与炎症性疼痛

炎症性疼痛又称炎性痛，是常见疼痛类型之一，广泛参与多种急慢性疾病。有研究结果显示，EGFR可能参与炎性痛的发生，但其在不同药物诱导炎性痛模型中的作用存在差异。如Martin 等[19]观察到足底注射20 μl 完全弗氏佐剂 (complete Freund's adjuvant,CFA) 致炎性痛小鼠模型，造模后3 天时CFA 小鼠患侧L3～L5DRG 中EGFR 磷酸化蛋白表达增至造模前的2 倍左右。Mizobuchi 等[22]研究结果则显示，成年大鼠左足底注射100 μl CFA 3 天后，双侧L4～L5DRG EGFR mRNA 表达并无差异。关于EGFR 在炎性痛的作用研究，不同团队报道结果并非一致，推测可能与药物注射剂量、鼠种不同有关。采用腹腔高剂量(100 mg/kg)注射Gefitinib、AG1478 和拉帕替尼 (Lapatinib) EGFR 受体抑制剂30 分钟后，能够降低福尔马林小鼠舔/咬患侧足爪的频率，但并不影响其患侧足爪的水肿程度；角叉菜胶致炎性痛小鼠腹腔注射EGFR 抑制剂(AG1478) 20～40 分钟可完全逆转热过敏反应[19]。这提示EGFR 参与炎性痛的发展，但具体作用机制并不清楚。鞘内注射特异性配体EREG 激活EGFR 可加重后期福尔马林致炎性痛小鼠机械性痛觉异常和热痛觉过敏；体外实验初步证实，EREG 激活EGFR 引发疼痛反应可能与其增加DRG 神经元瞬时感受器电位香草酸受体1 (transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1) 表达，激活胞内mTOR/eIF4F (eukaryotic initiation factor-4F, eIF4F)/基质金属蛋白酶9 (matrix metalloproteinase-9, MMP-9)信号传导通路有关[19]。

3.EGFR 与骨癌痛

近年恶性肿瘤发生率逐年上升，癌性疼痛成为影响癌症病人生存的关键因素，临床上骨转移引起的疼痛是最常见的癌症疼痛类型之一，因此建立了将癌细胞直接注入骨髓的骨癌痛模型[23]。骨癌痛(bone cancer pain, BCP)由原发性肿瘤或其他肿瘤转移到骨骼所致，包括炎性痛和神经病理性疼痛，是一种复杂的混合性疼痛。

EGFR 在BCP 大鼠脊髓中mRNA 和蛋白表达并未出现差异，而诱导建立吗啡耐受后则可出现明显上调。有研究报道[20]，与假手术组相比，BCP 大鼠造模后17 天患侧L4～L6脊髓节段中p-EGFR 和t-EGFR mRNA 和蛋白表达均无差异；建立BCP 大鼠吗啡耐受模型，观察到吗啡给药5 天后患侧脊髓中p-EGFR 和t-EGFR mRNA 逐渐上调。借助于药理学、基因干扰和细胞实验等手段，进一步来验证EGFR 在介导骨癌痛中的作用及其下游机制。于BCP-吗啡耐受大鼠L3～L4节段鞘内注射EGFR 抑制剂AG1478，显著降低患侧L4～L6脊髓节段中EGFR和ERK1/2 总蛋白和磷酸化水平，逆转BCP 大鼠吗啡耐受引起的机械异常性疼痛，提示EGFR 可能通过调节其下游ERK通路来介导机械性痛觉过敏[20]。Furugaki 等[24]报道体内注射EGFR 抑制剂厄洛替尼(Erlotinib)，骨转移病灶肿瘤细胞中p-EGFR 表达并未减少，然而加入到NCI-H292 癌细胞中可明显阻断EGFR 磷酸化和随后RAS/RAF/MAPK 和PI3K/AKT 的下游信号级联反应活化，两者实验结果相反，其原理尚未研究。Liang 等[25]观察到Y-框结合蛋白(Y-box binding protein 1, YBX1) 是一种致癌基因能够激活脊索瘤中AKT 通路，其过表达促进了脊索瘤细胞系中EGFR 和AKT 磷酸化表达；将EGFR受体抑制剂加入到脊索瘤细胞中能够阻断EGFR 和AKT 磷酸化。乳腺癌骨转移模型中使用EGFR shRNA干扰可以减少由癌细胞导致的骨质破坏[26]。以上研究表明，EGFR 参与吗啡耐受诱导痛觉过敏、癌细胞诱导骨质破坏等，但与骨癌痛的关系尚未明确，还有待于进一步深入研究予以阐释。

根据以上现有研究结果，初步推断EGFR 在不同动物种属、不同疼痛类型中表达存在差异。背根神经节EGFR 活化仅参与小鼠炎性痛，并不参与大鼠炎性痛；背根神经节EGFR 活化介导了各类神经病理性疼痛过程；目前尚未观察到EGFR 介导骨癌痛发生。PI3K/AKT/mTOR、Ras/Raf/MEK/ERK、JAK/STAT等信号通路可能参与EGFR 激活后的信号传递，还需进一步研究验证。

四、展望

EGFR 除了参与肿瘤细胞相关活动外，还被关注到介导疼痛，成为疼痛研究领域中的一个新靶点。然而，基于目前研究现状，关于EGFR 与疼痛的相关性研究相对偏少，其在不同类型疼痛中的角色尚不能全方位呈现；不同部位EGFR 介导疼痛中是否存在作用差异，EGFR 介导肿瘤细胞相关活动与介导疼痛是否存在调控机制差异等系列问题还亟待解决，有待于进一步深层次研究为揭示EGFR 介导疼痛的作用及其内在调控机制奠定前期研究基础。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。