高效液相色谱法同时测定清肝益脾胶囊中靛蓝和靛玉红含量*

徐明昊，王斯琦，苏子衡，潘韵芝，程军平△

（1. 南京中医药大学附属苏州市中医医院，江苏苏州 215000； 2. 江苏省苏州市第五人民医院，江苏苏州 215000）

清肝益脾胶囊系中医临床经验方，具有改善肝功能、降酶、退黄，增强细胞免疫功能，有疏肝健脾、清利湿热功效。该方以泥鳅为君药，清热疏肝、调节免疫，辅以臣药青黛抗炎保肝，最后佐以僵蚕提高机体免疫力，全方配伍得当，临床治疗慢性乙肝的疗效良好［1-2］。但现行质量标准中检测项仅有制剂通则要求的项目，不利于清肝益脾胶囊的质量控制。青黛药材中靛蓝和靛玉红为发挥抗肝损伤的主要有效成分。本研究中通过查阅文献［3 - 5］，建立了同时测定清肝益脾胶囊中靛蓝和靛玉红含量的高效液相色谱（HPLC）法，以为该制剂的质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型液相色谱仪（美国Agilent公司），包括四元泵，全自动进样器，检测器，蒸发光散射检测器，工作站；XO-5200DTD型超声波清洗机（南京先欧仪器制造有限公司）；1-14K型高速离心机（美国Sigma-Aldrich公司）；PL203型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 试药

清肝益脾胶囊（苏州市第五人民医院自制，批号分别为20200808，20201019，20210228）；靛蓝对照品（批号为J1726025，含量≥98%），靛玉红对照品（批号为20121805，含量≥98%），均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇（色谱纯，江苏强盛功能化学股份有限公司，批号为20210401）；N，N-二甲基甲酰胺（色谱纯，生工生物工程上海股份有限公司，批号为G506BA1009）；其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS柱（250 mm×4.6 mm，25 μm）；流动相：甲醇-水（70∶30，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：290 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

分别取靛蓝、靛玉红对照品13.20，11.40 mg，精密称定，分别置100 mL容量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺适量，超声（功率250 W、频率40 kHz，下同）使溶解，再加N，N-二甲基甲酰胺定容，摇匀，即得单一对照品贮备液；各取适量，加N，N-二甲基甲酰胺制成混合对照品溶液。取样品内容物粉末约0.1 g，精密称定，置100 mL磨口锥形瓶中，精密加入N，N- 二甲基甲酰胺10 mL，称定质量，在25 ℃下超声提取30 min，放冷，再次称定质量，用N，N-二甲基甲酰胺补足减失的质量，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得质量浓度为10.00 mg/mL的供试品溶液。按清肝益脾胶囊处方及工艺制备不含青黛药材的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液［6-9］。

2.3 方法学考察

系统适用性试验及专属性试验：精密量取2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱中，与对照品溶液色谱有相同色谱峰，各色谱峰基线分离良好，且阴性对照无干扰。详见图1。

图1 高效液相色谱图1.Indigo 2.Indirubin A.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：取靛蓝、靛玉红对照品各适量，精密称定，分别加入N，N- 二甲基甲酰胺溶液制成质量浓度分别为7.63，15.25，30.50，61.00，122.00 μg/mL和5.00，10.00，20.00，40.00，80.00 μg/ mL 的系列对照品溶液。各取10 μL，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以待测成分质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程，靛蓝为Y1=40.493X1+76.128（R2=0.999 8，n=5），靛玉红为Y2=34.631X2-9.045 8（R2=1.000 0，n=5）。结果表明，靛蓝和靛玉红质量浓度分别在7.63～122.00 μg/mL和5.00～80.00 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好［10］。

精密度试验：取2.2项下同一批（批号为20201019）供试品溶液适量，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果靛蓝、靛玉红峰面积的RSD分别为0.20%和2.13%（n=6），表明方法精密度良好。

稳定性试验：取同一批（批号为20201019）供试品溶液适量，分别于室温下放置0，2，4，6，8，10，12，24 h时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果靛蓝和靛玉红峰面积的RSD分别为0.46%和2.31%（n=8），表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

重复性试验：取样品（批号为20201019）内容物适量，共6 份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进行测定，记录峰面积，并计算含量。结果靛蓝、靛玉红含量的RSD分别为0.26%和2.10%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取已知含量的供试品溶液6 份，分别精密加入2.2 项下混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。

2.4 样品含量测定

取3 批样品内容物各适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，计算样品中靛蓝和靛玉红含量。结果见表2。

表2 样品中靛蓝和靛玉红含量测定结果（μg/mg，n=3）Tab.2 Results of content determination of indigo and indirubin in samples（μg/mg，n=3）

3 讨论

3.1 色谱条件优化

预试验中，考察了甲醇-水流动相比例，以待测色谱峰的峰形和分离度为考察指标，发现为甲醇- 水为70∶30（V/V）时靛蓝和靛玉红的出峰时间适宜，色谱峰峰形良好、柱效高；又考察了25，30 ℃柱温下的图谱，发现30 ℃时的色谱峰峰形好、柱效高；还考察了流速，发现1.0，0.5 mL/ min 流速下出峰时间适宜、峰形好，综合时效，最终选择流速为1.0 mL/min。

3.2 样品含量测定结果分析

清肝益脾胶囊是3味药材粉末填充胶囊，在制备供试品溶液时采取超声提取法，取胶囊中的混合药粉，精密称定，加入N，N-二甲基甲酰胺溶液，超声30 min 提取靛蓝、靛玉红；此外，研究中还发现清肝益脾胶囊中靛蓝的含量受药品贮存时间的影响，其原因可能是青黛药材中靛蓝和靛玉红是同分异构体，由于光照、温度和时间等因素的影响，可能发生相互转化，但含量均在合理范围内，因此药品在贮存时应尽可能将其置避光处，并放入棕色瓶进行避光，同时要保证供试品溶液在24 h 内测定完毕。制剂中靛玉红含量稳定性较好，说明该检测方法具有科学性和准确性。

3.3 制剂质量标准提升的必要性

清肝益脾胶囊是苏州市第五人民医院的协定方，具有多年的临床实用经验，根据临床数据显示，该处方治疗肝纤维化效果较佳，在治疗肝损伤疾病方面有良好作用，用清肝益脾胶囊治疗1 000 例乙肝患者，总有效率达85%，发现清肝益脾胶囊在调节机体免疫力、清除复合物及机体的肝细胞恢复等方面有重要作用［11］。但清肝益脾胶囊现有质量标准不足以验证药品的安全性、稳定性及有效性［12］。优化生产工艺、不断提高质量控制水平和质量标准是院内制剂发展的必由之路［13］。

3.4 方法评价

本研究中建立的方法操作简便，结果准确，专属性强，可用于清肝益脾胶囊的质量控制，保障院内制剂的品质和制剂工艺的稳定，并可为制剂质量标准的提高提供依据。