杏鲍菇液体发酵沛县黄皮牛蒡对多糖含量影响的研究

董玉玮，朱曹凯，顾鑫玥，李 超，冯星星，胡传银，秦琰琪

（1. 徐州工程学院食品与生物工程学院，江苏徐州 221018；2. 徐州天马敬安食品有限公司，江苏徐州 221747；3. 沛县农业农村局，江苏 徐州 221600）

牛蒡是菊科两年生植物，也被人们称为蒡翁菜，主要种植于北欧和中国浙江、河北以北、江苏江北及东北等地区[1]。牛蒡中含有蛋白质、矿物质、纤维素、糖类，以及各种氨基酸和维生素，具有较高的营养价值[2]。同时，牛蒡根还具有较好的药用功能，能降血脂、降血压、清理肠道、增强人体调节免疫能力[3-4]。

杏鲍菇（Pleurotus abalone） 又名刺芹侧耳，属无隔担子菌亚纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属。杏鲍菇因其口感和鲍鱼类似，且有着杏仁的香味而得名[5]。杏鲍菇多分布于欧洲、非洲的北部和亚洲的部分地区。杏鲍菇营养组分丰富，含有人体所需的微量元素，其营养成分主要有糖类、蛋白质、矿物质元素等，能有效调节机体代谢水平，改善机体性能[6]。其中，杏鲍菇多糖作为杏鲍菇的主要提取物之一，可以有效提高机体免疫力，促进机体对营养物质均衡吸收，对病菌、肿瘤等有较强地抑制作用[7-8]。

液体发酵技术作为现代生物技术的重要组分之一，是利用微生物生长速度快、生长所需条件简单等特点，使微生物在合适的条件下大量生产、繁殖、代谢，生产出人们所需求的菌株或代谢中产物的过程[9]。其中，食用菌液体发酵与固体发酵相比，产量较高、成本更低、发酵周期短，具有更高的经济效益[10]。

牛蒡根中含有大量纤维素，同时含有蛋白质、矿物质、维生素，少量的绿原酸、多糖。微生物，尤其是一些药食真菌，比如营养、保健价值较高的杏鲍菇、灵芝、毛木耳、茶树菇等，具有分解、利用纤维素的能力，牛蒡中含有的蛋白质、维生素、矿物质等也可作为菌种生长提供营养成分，有助于充分利用牛蒡、食用菌等资源。该研究采用牛蒡根作为培养基，以杏鲍菇液体发酵牛蒡根，提取并检测发酵液中的多糖，探讨影响多糖含量的因素，为牛蒡、药食真菌精深加工提供了技术支撑，具有较好的实际应用价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料、试剂和仪器

1.1.1 试验材料和试剂

沛县黄皮牛蒡，徐州天马敬安食品有限公司提供；杏鲍菇菌种，实验室保存的高活性杏鲍菇菌种。

葡萄糖、硫酸亚铁、硫酸镁、磷酸二氢钾、琼脂、浓硫酸、95%乙醇等试剂，南京晚晴化玻仪器有限公司提供。

1.1.2 试验仪器

HBT-DV24-566B 型蒸汽灭菌锅，华东强剑工业装备公司产品；FGY-856YU 型冰箱徐州美的电器产品；DC14962 型电子天平，南通南方六岛贸易有限责任公司产品；LL.R98.402-H-II 型恒温培养箱，上海富强仪器制造公司产品；GH-XC-5P 型洁净紫外工作台，无锡纯洁设备有限责任公司产品；F48692型可见分光光度计，江苏山岳科技有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基配方

PDA 培养基：20%马铃薯，2%葡萄糖，0.3%KH2PO4，0.3%酵母膏，0.15%MgSO4，2%琼脂。

牛蒡液体培养基：1%～5%去皮牛蒡块，大小0.1～0.2 cm3，1%酵母膏，按比例加水配制，高压灭菌后备用。

1.2.2 菌种的活化与液体培养

使用PDA 培养基活化杏鲍菇菌种，于27 ℃下恒温培养6 d。

液体培养：将活化后的杏鲍菇菌株接种到配置好的牛蒡液体培养基中，置于28 ℃条件下，以转速120 r/min 培养5～7 d。

1.2.3 单因素试验

为研究牛蒡液体培养基对发酵杏鲍菇菌株的影响，该试验设计3 个单因素，分别为牛蒡含量、温度、装液量，主要考查各因素对杏鲍菇多糖的产量的影响，试验做3 次，取平均值。

（1） 牛蒡含量。分别向装有100 mL 牛蒡液体培养基的三角瓶中加入1%，2%，3%，4%，5%的牛蒡，高压灭菌20 min 后，无菌接种，在28 ℃摇床中以转速120 r/min 培养5～7 d。

（2） 温度。5 个装有100 mL 牛蒡液体培养基的三角瓶中，均含有质量体积比3%的牛蒡，高压灭菌20 min 后，无菌接种，分别放入温度为24，26，28，30，32 ℃的摇床中，以转速120 r/min 培养5～7 d。

（3） 装液量。向5 个三角瓶中分别加入60，80，100，120，140 mL 的质量体积比3%的牛蒡液体培养基，高压灭菌20 min 后，无菌接种，在温度为28 ℃的摇床中，以转速120 r/min 培养5～7 d。

1.2.4 响应面试验设计

在单因素试验后，取最优结果及附近的一共3 组数据，使用Design Expert 8.05b 软件，设计方案，并按照软件给出的方案进行试验，得出结果。

试验的因素与水平设计见表1。

表1 试验的因素与水平设计

1.2.5 多糖的提取及测定[11-12]

（1） 粗多糖的提取方法。将发酵完成的培养基离心取上清，置于50 ℃的烘箱中浓缩至原体积的1/5，向其中加入5 倍体积的95%乙醇溶液，置于4 ℃冰箱中过夜，次日离心取沉淀，烘干后所得即为杏鲍菇粗多糖。

（2） 粗多糖的纯化。将杏鲍菇多糖的粗提物用10 mL 纯水溶解，并向其中加入多糖溶液体积1/4～1/3 的Sevag 试剂（氯仿- 正丁醇4∶1 的混合液），将其倒入分液漏斗中，上下振荡15～20 min 后，静置分层，倒出下层废液，将上清液以转速4 000 r/min离心15 min，取上清液，重复上述操作，直至没有蛋白质析出，将上清液收集备用。

取一段截流分子量为6 000～8 000 的半透膜袋，置于沸水锅中煮5 min，用纯水将半透膜冲开，封住半透膜一侧，将收集的上清液倒入其中，将另一端也封好，将处理好的透析袋悬挂于装有蒸馏水的烧杯中，打开磁力搅拌器，每2 h 换一次水，透析1～2 d，最终得到的样品即为杏鲍菇的精多糖溶液，烘干可得多糖样品。

（3） 多糖含量的测定。苯酚硫酸法测多糖：向多糖样品中加入100 mL 纯水溶解，取2 mL 加于试管中，另取一空试管加入2 mL 蒸馏水，向其中加入1 mL 质量分数为6%的苯酚溶液和5 mL 浓硫酸，摇匀后静置5 min，置于100 ℃的水浴锅中水浴15 min，冷却至室温，并于波长490 nm 处测量样品吸光度，并根据回归方程计算多糖含量。

1.2.6 高效液相色谱法检测多糖中单糖组分

称取适量的冻干多糖样品，加入浓度为2 mol/L的三氯乙酸（TFA） 溶液0.5 mL，置于120 ℃下水解120 min，用氮吹仪吹干。

向试管中加入5 μL 单糖标准品，混匀。加入浓度为2 mol/L 的三氯乙酸（TFA） 溶液0.5 mL，与样品同时在120 ℃条件下水解120 min，再用空气泵吹干。向处理后的单糖样品中加入溶于无水甲醇的0.5 mol/L的1- 苯基-3- 甲基-5- 吡唑啉酮（PMP） 试剂和0.3 mol/L 的氢氧化钠溶液各0.5 mL，混匀，置于70 ℃中水浴30 min。冷却至室温，加入0.3 mol/L HCl 溶液0.5 mL，混匀。加入氯仿0.5 mL，充分振荡萃取，置于5 000 r/min 的离心机中离心5 min去除氯仿层，共萃取3 次。水层（不低于0.4 mL）用0.22 μm 滤膜过滤后，待上机。

仪器条件：色谱柱：SHISEIDO C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为0.1 mol/L pH 值6.8 磷酸盐缓冲液（PB），乙腈为82∶18（V/V），流速为1.0 mL/min，柱温为25 ℃，进样量10 μL，波长为245 nm。

1.3 数据分析

所有的数据都用平均值±标准差（X±S） 来表示，Origin 9.0 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 不同牛蒡含量对杏鲍菇多糖质量浓度的影响

牛蒡含量对发酵液中多糖质量浓度的影响见图1。

图1 牛蒡含量对发酵液中多糖质量浓度的影响

由图1 可知，当牛蒡含量为1%～5%时，发酵液多糖含量会随着牛蒡含量的变化而变化，多糖质量浓度先逐渐升高，在牛蒡含量为3%时，达到最大值，为2.38 mg/mL，随着牛蒡含量的再度升高，多糖质量浓度则呈现下降趋势。

2.1.2 装液量的确定

装液量对发酵液中多糖质量浓度的影响见图2。由图2 可知，当装液量体积为60～140 mL 时，发酵液多糖质量浓度会随着装液量的变化而变化，多糖含量先逐渐升高，在装液量为100 mL 时，达到最大值，为2.41 mg/mL ，随着装液量的再度升高，多糖质量浓度则呈现下降趋势。

图2 装液量对发酵液中多糖质量浓度的影响

2.1.3 温度的确定

温度对发酵液中多糖质量浓度的影响见图3。

图3 温度对发酵液中多糖质量浓度的影响

由图3 可知，当温度为24～32 ℃时，发酵液多糖质量浓度随温度的变化而变化，多糖质量浓度先逐渐升高，在温度为28 ℃时，达到最大值，为2.39 mg/mL，随着温度的再度升高，多糖质量浓度则呈现下降趋势。

2.2 Box-behnken 试验设计

Box-behnken 试验设计方案及通过具体试验得到的多糖含量的预测值与实际值。

设计方案和结果见表2。

表2 设计方案和结果

2.3 回归方程的建立和方差分析

对上表中的数据进行整理分析，可得三因素装液量（X1）、温度（X2）、牛蒡含量（X3） 的回归方程：

试验结果的方差分析见表3，杏鲍菇多糖质量浓度预测模型的可靠性分析见表4。

表3 试验结果的方差分析

表4 杏鲍菇多糖质量浓度预测模型的可靠性分析

由表3、表4 可知，该模型的p 值＜0.01，所以该模型具有极显著影响；此外，该模型的失拟向p值＞0.05，不具备显著影响。X1和X3的p 值＜0.01，反映出X3和X1对多糖质量浓度的变化有着极显著影响，而X2的p 值＜0.05，说明温度水平变化对多糖质量浓度有着显著影响；最后，X2X3的p 值＞0.05，表明温度和牛蒡含量交互作用对多糖质量浓度影响不显著，X1X3的p 值＜0.01，表明装液量和牛蒡含量的交互作用对多糖质量浓度的影响极显著，而X1X2的p 值＞0.05，说明装液量和温度进行交互作用对多糖质量浓度无显著影响。模型决定系数R2为0.999 1，经校正后的决定系数R2Adj为0.998 0，由此可得知该模型的拟合程度较好，具有可靠性。

2.4 因素间的交互作用分析

使装液量、温度、牛蒡含量3 个影响因素中的一个保持不变，在此基础上分析其他2 个因素的交互作用对多糖质量浓度的影响，得到的等高线及响应面图。

装液量、温度和牛蒡含量两两之间交互作用对多糖含量影响的等高线图和三维图见图4。

图4 装液量、温度和牛蒡含量两两之间交互作用对多糖质量浓度影响的等高线图和三维图

由图4 可知，等高线与圆形越接近，说明对多糖质量浓度的影响越小，由此可以得知，这3 个因素两两之间交互作用中，装液量和牛蒡含量的交互作用对多糖质量浓度影响最大。

除此以外，3 个曲线都呈抛物线形，单个因素影响程度的大小可以通过响应面图中曲线的变化幅度来判断，曲线越陡，说明这个因素影响程度越大，由此可以得知3 个因素的影响程度大小依次为装液量＞牛蒡含量＞温度，因此试验的优化方法具有可行性。

2.5 优化后的最佳条件及结果

通过对上面数据的分析，可以对牛蒡杏鲍菇液体发酵工艺条件进行改良，得到最佳提取工艺为牛蒡含量占总装液量3%，装液量为100 mL，温度为28 ℃时，得到的多糖质量浓度最大为2.39 mg/mL。

2.6 多糖中单糖组分的检测

杏鲍菇多糖单糖组分含量结果见表5。

表5 杏鲍菇多糖单糖组分含量结果/mg·kg-1

结果表明，发酵液多糖单糖组分包含甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。谭霄等人[13]采用高效液相色谱- 蒸发光散射法分析测定杏鲍菇多糖的单糖组成，发现杏鲍菇多糖中含有甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖，与此次测定相比多了核糖、鼠李糖和岩藻糖。发酵液多糖单糖组分含量中，葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖含量较高，其中葡萄糖的含量最高。薛令坤等人[14]研究杏鲍菇多糖发现，葡萄糖含量较甘露糖、半乳糖含量高，与该研究结果基本一致。

3 结论

（1） 通过单因素试验，可以得出当培养基中牛蒡含量达3%时，多糖质量浓度最高为2.38 mg/mL，装液量为100 mL 时，多糖质量浓度达到最大值为2.41 mg/mL，培养温度为28 ℃时，多糖质量浓度达到最大值为2.39 mg/mL。

（2） 采用响应面方法优化后，得出最佳方案为牛蒡含量3%，装液量为100 mL，温度为28 ℃时，预测得到的最大多糖质量浓度为2.39 mg/mL。

（3） 通过对发酵液的粗多糖进行纯化后，用高效液相色谱法测定其单糖组分，得到发酵液多糖中主要有葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸等多种单糖，其中葡萄糖含量最高。