河南省油菜菌核病菌对氟吡菌酰胺及其复配剂的敏感性

苗淑斐, 李路怡, 钱 乐, 徐建强, 姜 佳, 刘圣明

(河南科技大学 园艺与植物保护学院 植物保护系，河南 洛阳 471023)

由核盘菌Sclerotinia sclerotiorum引起的菌核病是油菜生产上的重要病害，在我国各地区均有发生，以长江中下游和东南沿海最为严重，发病率在10%～80%之间，产量损失在5%～30%之间[1-2]。菌核病在油菜幼苗至成株期间均可发生，其中在花期发生较为严重，可危害植株上部各部位，尤以茎秆受害最严重[3-5]。由于目前尚未发现高抗菌核病的油菜品种，每年都会因菌核病而遭受巨大的经济损失[6-7]。油菜菌核病在生产中的防治主要采用在油菜主茎开花95%时，喷施苯并咪唑类杀菌剂多菌灵、二甲酰亚胺类杀菌剂菌核净和三唑类杀菌剂戊唑醇等化学药剂[8-11]，但是由于长期使用单一化学药剂，容易导致病原菌对其产生抗药性，使其田间防治效果下降[12-13]。因此，迫切需要不同作用机制的新型杀菌剂用来防控油菜菌核病。

氟吡菌酰胺 (fluopyram) 是拜耳作物科学公司开发的一种吡啶-乙基-苯甲酰胺琥珀酸脱氢酶抑制剂类 (SDHI) 杀菌剂，2009 年上市，具有广泛的杀菌谱，对菌核病菌、灰霉病菌、白粉病菌和靶斑病菌等多种病原真菌具有较好的抑菌活性[14-15]。而2010 年至今，氟吡菌酰胺在我国仅登记用于黄瓜等作物白粉病、灰霉病、靶斑病和根结线虫的防治。目前，其尚未在油菜上获得登记 (http://www.chinapesticide.org.cn/)，关于河南省油菜菌核病菌对氟吡菌酰胺的敏感性也未见报道。因此，本研究采用菌丝生长速率法测定了2015 年和2016 年从河南省5 个地市采集的127 株油菜菌核病菌对氟吡菌酰胺的敏感性，建立了油菜菌核病菌对氟吡菌酰胺的敏感性基线；同时，采用菌丝生长速率法测定了氟吡菌酰胺、丙硫菌唑、叶菌唑、多菌灵、咯菌腈和菌核净6 种杀菌剂及其复配剂对油菜菌核病菌的联合毒力，旨在为河南省油菜菌核病菌对氟吡菌酰胺的抗药性监测和油菜菌核病的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株 2015—2016 年从河南省平顶山、漯河、周口、郑州和驻马店5 个地市采集并单菌核分离得到127 株油菜菌核病菌菌株，由河南科技大学杀菌剂生物学实验室保存。

1.1.2 供试药剂 供试杀菌剂均为原药，96%氟吡菌酰胺 (fluopyram)，拜耳作物科学 (中国) 有限公司；97%丙硫菌唑 (prothioconazole)，山东海利尔化工有限公司；95%叶菌唑 (metconazole)，江苏辉丰生物农业股份有限公司；98% 多菌灵(carbendazim)，江苏龙灯化学有限公司；98%咯菌腈 (fludioxonil)，先正达农作物保护股份公司；95%菌核净 (dimethachlone)，江西禾益化工股份有限公司。将多菌灵原药预溶于0.1 mol/L 稀盐酸，氟吡菌酰胺、丙硫菌唑、叶菌唑、咯菌腈和菌核净原药分别预溶于丙酮，配制成至质量浓度为104μg/mL 的母液，置于4 ℃冰箱中保存，备用。

1.1.3 供试培养基 PDA 培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15～20 g，蒸馏水1 L。

1.2 试验方法

1.2.1 油菜菌核病菌对氟吡菌酰胺的敏感性 采用菌丝生长速率法测定[16]。将氟吡菌酰胺母液系列稀释，按照一定的比例分别加入到经灭菌热熔冷却至50～55 ℃的PDA 培养基中，制成含氟吡菌酰胺0.0016、0.0063、0.025、0.10 和0.40 μg/mL系列质量浓度的PDA 平板，以加入等体积丙酮、不加药剂的PDA 平板作为对照。将供试菌株在25 ℃黑暗条件下培养2 d，在菌落边缘打取直径为5 mm 的菌饼，转移至PDA 平板上。将PDA平板置于恒温培养箱中，25 ℃黑暗条件下培养2 d，采用“十”字交叉法测量菌落直径，记录各菌落平均直径。各处理3 次重复，试验重复3 次。按公式 (1) 计算各浓度处理下药剂对菌丝的生长抑制率(I)[17]。

式中：Dck为对照菌落直径，cm；Dt为处理菌落直径，cm。利用DPS 软件，通过抑制率几率值 (y)与药剂质量浓度对数值 (x) 之间的线性回归关系，求出毒力回归方程、有效抑制中浓度(EC50值) 及相关系数。

1.2.2 敏感性分布图绘制 将供试的油菜菌核病菌群体对氟吡菌酰胺的敏感性由高到低分成不同的区间，统计各菌株EC50值在每个区间的分布频率 (%)。以EC50值的区间范围为横坐标，对应区间EC50值的频率为纵坐标，绘制油菜菌核病菌对氟吡菌酰胺的敏感性频率分布图，建立其敏感性基线。

1.2.3 杀菌剂单剂及其复配剂对油菜菌核病菌对的毒力测定 采用菌丝生长速率法[16]，测定氟吡菌酰胺、丙硫菌唑、叶菌唑、多菌灵、咯菌腈、菌核净6 种单剂以及氟吡菌酰胺与其他5 种药剂分别按照母液体积比为1 : 5、1 : 3、1 : 1、3 : 1、5 : 1 的复配剂对油菜菌核病菌菌株ZZ1606 的毒力。将各单剂和复配剂进行系列稀释，按照一定的比例分别加入到经灭菌热熔后冷却至50～55 ℃的PDA 培养基中，制成含氟吡菌酰胺、丙硫菌唑、叶菌唑、多菌灵、咯菌腈、菌核净单剂及其各复配剂系列质量浓度的PDA 平板(表1)。以加入等体积对应溶剂、不加药剂的PDA 平板为对照。按照1.2.1 节敏感性测定和计算方法，求出各单剂及其复配剂的EC50值。利用公式 (2) 求出各复配剂理论抑制中浓度[EC50(Exp)]，利用公式 (3) 求出增效系数 (SR) 值，当SR 值大于1.5 时为增效作用，在0.5 和1.5 之间为相加作用，小于0.5 时为拮抗作用[18]。

表1 供试杀菌剂及其复配剂对油菜菌核病菌毒力测定使用的浓度梯度Table 1 The concentration of the fungicide and their mixtures was used to determine the toxicity to Sclerotinia sclerotiorum

式中：A，B 为复配的药剂；a，b为药剂在配方中所占的比例；EC50(Exp)为理论抑制中浓度，μg/mL；EC50(Obs)为实际测量抑制中浓度，μg/mL。

1.3 数据处理

数据处理数据分析利用Excel 2013 和DPS v7.05统计软件，得出药剂抑制菌丝生长的毒力回归方程、相关系数r和EC50值，采用显著性最小差异法 (Least-Significant Difference, LSD,P＜ 0.05) 进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 油菜菌核病菌对氟吡菌酰胺的敏感性

测定结果 (表2) 显示：氟吡菌酰胺对河南省127 株油菜菌核病菌的EC50值范围为0.0100～0.0989 μg/mL，平均值为 (0.0546 ± 0.0228) μg/mL。不同地市间的菌株对氟吡菌酰胺的敏感性差异不显著：平均EC50值变化范围在 (0.0482 ± 0.0240)～(0.0609 ± 0.0138) μg/mL 之间，其中从郑州分离鉴定到的菌株对氟吡菌酰胺最敏感，从驻马店分离鉴定到的菌株对氟吡菌酰胺最不敏感。氟吡菌酰胺对各市菌株的平均EC50值与其对127 株菌株的平均EC50值无显著差异。

表2 2015—2016 年河南省油菜菌核病菌对氟吡菌酰胺的敏感性Table 2 The sensitivity of S. sclerotiorum to fluopyram in Henan Province from 2015 to 2016

2.2 油菜菌核病菌对氟吡菌酰胺的敏感性基线分析

从频率分布直方图可以看出，供试油菜菌核病菌菌株对氟吡菌酰胺的敏感性呈连续单峰曲线(图1)，EC50最大值为最小值的9.89 倍，70%以上菌株的EC50值小于0.07 μg/mL，未发现敏感性下降的亚群体，表明氟吡菌酰胺对油菜菌核病菌菌丝生长具有较强的抑制作用，可将 (0.0546 ±0.0228) μg/mL 作为河南省油菜菌核病菌对氟吡菌酰胺的敏感性基线。

图1 河南省127 株油菜菌核病菌对氟吡菌酰胺的EC50 值分布曲线Fig.1 The distributed curve of EC50 value of fluopyram to 127 S. sclerotiorum isolates in Henan Province

2.3 杀菌剂及其复配剂对油菜菌核病菌的毒力

采用菌丝生长速率法测定 结果 (表3) 显示：氟吡菌酰胺、丙硫菌唑、叶菌唑、多菌灵、咯菌腈和菌核净6 种杀菌剂对菌株ZZ1606 的EC50值范围在0.0175～0.8978 μg/mL 之间，表明6 种药剂对油菜菌核病菌的菌丝生长均具有较好的抑制效果。

表3 氟吡菌酰胺及其复配剂对油菜菌核病菌的毒力Table 3 Toxicity of fluopyram and its mixtures to S. sclerotiorum

将氟吡菌酰胺与丙硫菌唑、叶菌唑、多菌灵、咯菌腈和菌核净分别按照1 : 5、1 : 3、1 : 1、3 : 1、5 : 1 体积比进行两元复配，测定复配剂对油菜菌核病菌的联合毒力。结果 (表3) 表明，不同组合、不同配比的复配剂对油菜菌核病菌的毒力不同，SR 值范围在0.51～5.86 之间，表现为相加作用或增效作用，其中V(氟吡菌酰胺) :V(咯菌腈) = 1 : 1 时，SR 值最大，增效作用最强。

3 结果与讨论

氟吡菌酰胺是一种新型的琥珀酸脱氢酶抑制剂类 (SDHI) 杀菌剂，是广谱高效内吸性杀菌剂，具有保护和治疗作用，通过作用于线粒体呼吸链的蛋白复合物Ⅱ，抑制琥珀酸脱氢酶的活性，从而抑制了病原菌的呼吸作用，使其能量代谢受阻碍，最终使病原菌的生长受到抑制[19-20]。本研究通过菌丝生长速率法测定了油菜菌核病菌对氟吡菌酰胺及其复配剂的敏感性，结果表明，氟吡菌酰胺对油菜菌核病菌菌丝生长具有较好的抑制作用。黄学屏等采用菌丝生长速率法测定了2016—2017年山东省不同蔬菜产区173 株来自黄瓜、番茄、茄子、西葫芦、芸豆和辣椒6 种作物上的菌核病病菌对氟吡菌酰胺的敏感性，结果显示，氟吡菌酰胺对173 株菌核病菌的EC50值分布范围为0.02～0.30 μg/mL，平均值为 (0.11 ± 0.01) μg/mL，EC50频率分布呈单峰曲线[21]。本研究的敏感性测定结果显示，氟吡菌酰胺对供试的127 株油菜菌核病菌的EC50值范围在0.0100～0.0989 μg/mL 之间，平均值为 (0.0546 ± 0.0228) μg/mL，EC50频率分布也是呈单峰曲线。同时，两地均未发现敏感性下降的亚群体。与山东省菌株相比，EC50频率分布范围更窄，菌株对氟吡菌酰胺的敏感性更高，这可能与菌株的寄主不同或者菌株的群体多样性有关。目前，氟吡菌酰胺尚未登记在油菜菌核病的防控上，本研究采集的油菜田块从未有使用过氟吡菌酰胺，因此，此平均EC50值 (0.0546 ± 0.0228)μg/mL 可以作为河南省油菜菌核病菌对氟吡菌酰胺的敏感性基线，为河南省油菜菌核病菌对氟吡菌酰胺的抗药性监测提供理论依据。

SDHI 类杀菌剂的作用位点单一，长期使用单一药剂，易导致病原菌抗药性群体的出现[21-23]。目前，田间已经检测到了抗SDHI 类杀菌剂啶酰菌胺的灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、茄丝核菌Rhizoctonia solani、链格孢菌Alternaria alternata和茄链格孢菌A.solani等病原菌亚群体[24-26]。但是，关于油菜菌核病菌对SDHI 类杀菌剂的田间抗药性群体报道较少[27-28]。毛玉帅采用菌丝生长抑制法测定了2018 和2019 年江苏省油菜菌核病菌对啶酰菌胺的抗药性，结果未检测到啶酰菌胺抗性菌株[27]。但是，Li 等对2014 年从四川省采集的399 株油菜菌核病菌进行抗药性检测，结果检测到1 株抗啶酰菌胺的田间菌株[28]。由于本研究的供试菌株采集分离较早，且目前氟吡菌酰胺尚未在油菜上登记，未发现抗药性菌株，后续将增加菌株的采集，监测油菜菌核病菌对氟吡菌酰胺的抗药性发展。采用不同作用机制的杀菌剂复配使用，是阻止或延缓病原菌抗药性发生的主要策略。本研究测定了SDHI 类杀菌剂氟吡菌酰胺、三唑类杀菌剂丙硫菌唑和叶菌唑、苯并咪唑类杀菌剂多菌灵、苯吡咯杀菌剂咯菌腈和二甲酰亚胺类杀菌剂菌核净单剂及其复配剂对油菜菌核病菌的毒力。结果显示，各杀菌剂及其复配剂对油菜菌核病菌均具有较高的毒力，且各复配剂表现相加或增效作用。这可能是由于SDHI 类杀菌剂氟吡菌酰胺与这些杀菌剂具有不同作用机制，且各组合复配剂之间作用机理互不影响[22]。

综上所述，氟吡菌酰胺对油菜菌核病菌的生长具有较强的抑制作用，未发现敏感性下降的亚群体，平均EC50值 (0.0546 ± 0.0228) μg/mL 可以作为河南省油菜菌核病菌对氟吡菌酰胺的敏感性基线。氟吡菌酰胺与5 种杀菌剂复配剂对油菜菌核病菌均为相加或增效作用，在生产中可以将其与丙硫菌唑、叶菌唑、多菌灵、咯菌腈和菌核净两两复配使用。本论文的研究结果为油菜菌核病菌对氟吡菌酰胺的抗药性监测和油菜菌核病的防控提供理论。