QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法测定牛生乳中12 种脂溶性农药及其3 种代谢物残留

刘 阳, 邓仕萍, 刘 丹, 李姝慧, 孟紫薇

(中国农业大学 理学院，北京 100193)

牛生乳形成过程中的多个环节可能受到农药污染，如饲料原料中的农药残留；在储存、加工等过程中可能引入的农药残留；控制养殖场的卫生环境所使用的杀虫剂混入动物的饲料和饮用水中导致的农药残留等[1-2]。

目前，关于牛奶中农药残留的分析报道主要集中在有机氯类[3]、有机磷类[4-6]、氨基甲酸酯类[7]、新烟碱类[8]和菊酯类[9]等农药。牛奶作为脂溶性物质的良好载体，脂溶性农药更容易在牛奶中残留。正辛醇-水分配系数 (LogKow) 常被作为脂溶性指标，当农药的LogKow> 3 时被认为是脂溶性的[10]。本研究根据中国农药信息网上农药登记的饲料作物以及LogKow> 3，选取了目前在牛生乳基质中相关研究较少的12 种脂溶性农药及其代谢物，研究其在牛生乳中的残留水平。

目前，关于牛奶中农药残留检测的样品前处理方法主要有液液分配 (LLE)[7]、分散液液微萃取(DLLME)[8]、凝胶渗透色谱 (GPC)[11]、固相萃取(SPE)[12]、酶抑制法、免疫分析技术[13]、QuEChERS[14]等。其中，DLLME 能很大程度地节约溶剂，富集目标物，但方法优化影响因素多，操作复杂且平行性较差；LLE 和GPC 能除去样品中的脂类，但一般需耗费大量溶剂；SPE 净化能力强，但成本较高，处理过程较繁琐[15]；酶抑制法和免疫分析技术能快速、特异性地分析样品中的农药残留，但存在重现性差和适用范围窄等缺点。而QuEChERS方法因其简单、快速、低成本、高通量、溶剂用量少等优点，被广泛应用在高水分和高含油基质中农药残留的测定[16-19]。

牛奶中农药残留的检测方法主要有：气相色谱法[20]、气相色谱-质谱法[21]、气相色谱-串联质谱法[22]、高相液相色谱法[23]、液相色谱-质谱法[24]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等[25]。其中，液相色谱-串联质谱法因其灵敏度高、特异性强、分析速度快，成为农药多残留测定的首选方法[26]。本研究利用QuEChERS 前处理方法结合高效液相色谱-串联质谱 (HPLC-MS/MS) 检测手段，对牛生乳中我国尚未建立最大残留限量 (MRL) 值的12 种脂溶性农药及其3 种代谢物的残留分析方法进行研究，并对市售牛生乳进行抽检，旨在为我国牛生乳中农药MRLs 值标准的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 Agilent 6410B 液相色谱-三重四级杆串联质谱仪 (美国 Agilent 公司)；JY2002 型电子天平 (精度0.01 g，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；JA2003B 型电子天平 (0.001 g，上海越平科学仪器有限公司)；AUW220D 型电子分析天平(0.0001 g，日本岛津制作所)；VORTEX-5 型旋涡混合器 (海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；RJTDL-40B 型低速台式离心机 (无锡市瑞江分析仪器有限公司)；HC-2517 型高速离心机 (安徽中科中佳科学仪器有限公司)；0.22 μm 尼龙有机滤膜 (上海安谱实验科技股份有限公司)；1 mL 无菌医用注射器 (江苏治宇医疗器械有限公司)；50 mL 塑料离心管 (美国康宁公司)。

1.1.2 供试材料及试剂 牛生乳 (新疆布拉合农场)；甲酸、氯化钠和无水硫酸镁 (分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；甲醇和乙腈 (色谱纯，Fisher Chemicals 公司)；纯净水 (天津娃哈哈宏振饮料有限公司)；石墨化碳黑 (GCB，38～125 μm)、十八烷基硅烷键合硅胶 (C18，50 μm (60 Å)) 和N-丙基乙二胺 (PSA，40～60 μm (60 Å))，均购自天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.1.3 农药标准品 炔草酯 (纯度98.3%) 和炔草酸 (纯度99.1%)，购自上海市农药研究所有限公司；环丙唑醇 (纯度99.6%)，购自沈阳化工研究院有限公司；抑霉唑 (纯度98.5%)，购自国家农药质量监督检验中心；氟吡乙禾灵 (纯度98.3%)、氟吡禾灵 (纯度99.1%) 和乙螨唑 (纯度99%)，购自坛墨质检科技股份有限公司；肟菌酸 (纯度98%)、啶氧菌酯 (纯度99.6%)、唑螨酯 (纯度95%)、虱螨脲 (纯度98.7%) 和氟吡甲禾灵 (纯度98.0%)，购自德国 Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；吡氟酰草胺(纯度99.7%)，购自国家农药质量监督检验中心；肟菌酯 (纯度99.6%)，购自德国Bayer Corp Science；茚虫威 (纯度97.8%)，购自安到麦马克西姆有限公司。15 种目标化合物的具体信息详见表1。表中11 种农药在动物源性食品中的残留物定义来自(世卫组织/粮农组织) 农药残留联席会议 (JMPR)报告[27]，氟吡甲禾灵的残留定义来自GB2763—2021[28]；12 种农药的最大残留限量来自澳大利亚[29]和国际食品法典委员会(CAC)[30]。

表1 15 种目标化合物的CAS 号、分子式、LogKow、残留物定义、最大残留限量及登记饲料作物Table 1 CAS number, molecular formula, LogKow, definition of the residue, maximum residue limit (MRL) and registered feed crops of 15 target compounds

1.2 标准溶液配制

单一溶剂标准储备液：准确称取各标准品10 g(精确至0.0001g)，分别用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成质量浓度为1000 mg/L 的单一溶剂标准储备液，于 -18 ℃冰箱保存。

混合溶剂标准工作液：准确移取上述各单一标准储备液，用体积分数 (下同) 为1%的甲酸乙腈逐级稀释，配制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.4 和1 mg/L 的系列混合标准工作液。

1.3 样品前处理

准确称取10.0 g 牛生乳均质样品于50 mL 聚丙烯离心管中，加入10 mL 1%的甲酸乙腈溶液，涡旋提取3 min，加入3 g NaCl，涡旋5 min 后于3800 r/min 下离心 5 min。取3 mL 上清液至10 mL 聚丙烯离心管中，置于 -18 ℃冰箱冷冻5 h。取1 mL 上清液，加入装有100 mg C18的2 mL 离心管中，涡旋2 min，于10 000 r/min 下离心 1 min。取上清液，过 0.22 μm 有机系滤膜，待HPLC-MS/MS 测定。

1.4 HPLC-MS /MS 检测条件

1.4.1 液相色谱条件 Athena C18-WP 色谱柱(50 mm ×4.6 mm, 5 μm)；柱温 30℃；流速 0.3 mL/min；进样量 5 μL；流动相A 相为乙腈，B 相为体积分数为0.1%的甲酸水溶液。梯度洗脱程序：0～1.5 min，5%A；>1.5～6 min，55%～65% A；>6～9 min，65%～80% A；>9～10 min，80%～5% A；>10～15 min，5% A。

1.4.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，正离子模式下采用多重反应监测(MRM)模式采集数据。离子喷雾电压4000 V；雾化气压力240 MPa；干燥气流速10 L/min；干燥气温度350 ℃。MRM 模式下15 种目标化合物质谱参数详见表2。

表2 15 种目标化合物的保留时间和质谱参数Table 2 Retention time and mass spectrometry parameters of 15 target compounds

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 液相色谱条件的优化 1) 流动相的选择。在20 min 内，将有机相比例从0 线性升高至100%，考察了甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液在相同梯度洗脱条件下，对15 种目标化合物的分离度、响应值和峰形的影响。结果表明：以甲醇-水作为流动相时，20 min 内15 种目标化合物尚未完全出峰(图1 A-I)，说明此流动相体系出峰时间较晚；而以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相时，各目标化合物色谱峰形良好，响应值均能达到最低检测需求，单针运行时间短，色谱峰分离度更优 (图1 A-Ⅱ)。因此，选用乙腈-0.1%甲酸水溶液作为15 种目标化合物色谱分离的流动相。

图1 线性提高有机相比例时 (A) 及梯度洗脱程序下 (B) 15 种目标化合物的混合标准溶液 (0.1 mg/L) 的色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed standard solutions (0.1 mg/L) of 15 target compounds when linearly lifting the organic phase (A) and under gradient elution procedure (B)

2) 洗脱条件的优化。梯度洗脱总时间tg为20 min，第1 个峰为ti，最后1 个峰为tf，两者的差值Δtg= (tf-ti)。若 Δtg＜ 0.25tg，则适用等度洗脱；若Δtg> 0.25tg，则适用梯度洗脱。如图1 A-Ⅱ所示，ti(抑霉唑) 的保留时间为12.2 min，tf(唑螨酯) 的保留时间为18.7 min。Δtg= (ti-tf) = 6.5 min > 0.25tg(5 min)，表明该方法适合梯度洗脱。梯度洗脱程序按1.4.1 节所述，15 种目标化合物在此色谱条件下分离出11 个色谱峰，色谱图详见图1B。

2.1.2 质谱条件的优化 以乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相，在全扫描 M2 Scan 模式下提取母离子，SIM 模式下优化碎裂电压，比较正离子 (ESI+)和负离子 (ESI-) 扫描模式下15 种目标化合物的质谱响应值。结果发现，15 种目标化合物在 ESI+模式下均可得到稳定的[M + H]+离子峰，响应值明显优于 ESI-模式。以 Product Ion 为扫描类型确定碎片离子，取其中丰度较高的作为子离子，然后在MRM 模式下优化各子离子的碰撞能量，最终根据色谱峰的响应值确定不同化合物的定性离子和定量离子。15 种目标化合物的定性离子和定量离子详见表2。

2.2 提取方法的优化

QuEChERS 方法提取农药残留时，常以乙腈作为提取溶剂，乙腈在NaCl 盐析的作用下与水相分层，可以很好地去除蛋白质和糖类等极性物质[31]。本研究中12 种目标农药的LogKow> 3，脂溶性较强，在乙腈中有很好的溶解度。牛生乳中含蛋白质较多，仅以乙腈提取会导致蛋白质的共提取，为了减少蛋白质的共提取并提高牛生乳中15 种目标化合物的提取效率，考察了纯乙腈以及0.5%、1%和3%的甲酸乙腈对15 种目标化合物提取效果的影响，如图2 所示。

图2 提取溶剂对牛生乳中15 种目标化合物的回收率(A)和基质效应(B)的影响 (n = 3)Fig.2 Effects of extraction solvents on the recovery (A) and matrix effect (B) of 15 target compounds in raw milk (n = 3)

图2A 中，以乙腈为提取溶剂时，15 种目标化合物中除炔草酸、啶氧菌酯、炔草酯、氟吡甲禾灵、茚虫威和氟吡乙禾灵6 种化合物的回收率在92%～110%之间外，其余目标化合物的回收率在73%～97% 之间；以酸化乙腈为提取溶剂时，15 种目标化合物的回收率在87%～115%之间，表明乙腈的提取效率相对较低，而3 种酸化乙腈对目标物的提取效率之间差异不明显。图2B 的结果表明，以乙腈作为提取溶剂时，氟吡禾灵和肟菌酸的基质效应明显高于酸化乙腈的基质效应。但1%的甲酸乙腈溶液作为提取溶剂时的基质效应最弱。综上所述，选用1%甲酸乙腈溶液作为牛生乳中15 种目标化合物的提取溶剂。

2.3 净化方法的优化

2.3.1 低温冷冻除脂 在牛生乳基质中，影响回收率结果的主要是基质中的脂类，低温冷冻可以有效去除基质提取液中的脂肪[32-33]。本研究将3 mL 盐析后的提取上清液加入到10 mL 聚丙烯离心管中，置于低于 -18 ℃的冰箱中冷冻除脂。考察了冷冻时间分别为0、1、2、3、4 和5 h，对牛生乳基质提取液中15 种目标化合物的回收率和基质效应的影响。如图3 所示：低温冷冻0～5 h 内，15 种目标化合物在牛生乳中的回收率在81%～110%之间，RSD 在0.040%～2.7%之间。冷冻5 h 时，抑霉唑、炔草酸、氟吡禾灵、肟菌酸、啶氧菌酯、吡氟酰草胺和虱螨脲的基质效应均小于其他冷冻时间的，其余化合物的基质效应在 -5.7%～0.40%之间，均表现出轻度基质效应[34-35]，表明低温冷冻5 h 净化效果较好。

图3 冷冻时间对牛生乳基质提取溶液中 15 种目标化合物回收率(A)和基质效应(B)的影响 (n = 3)Fig.3 Effects of freezing time on recovery (A) and matrix effect (B) of 15 target compounds in raw milk ( n = 3)

2.3.2 净化剂种类的选择 牛生乳中主要含有脂肪、脂肪酸、蛋白质、乳糖等杂质。PSA 常用于除去糖类、脂肪酸和有机酸等极性杂质；C18的比表面积大、吸附能力强，可有效去除脂肪和脂类等非极性杂质[36]。无水MgSO4不仅可以去除体系中残余的水分，也能通过微放热效应减少其他净化剂对目标物的吸附[13]。本研究中，考察了C18、PSA、C18+ 无水MgSO4和PSA + 无水MgSO44 种净化方式对牛生乳基质提取液净化效果的影响。结果 (图4) 表明：分别以PSA、PSA + 无水MgSO4和C18+ 无水MgSO4为净化剂时，啶氧菌酯、肟菌酸、炔草酸、氟吡禾灵的回收率均不能满足农药残留分析回收率在 70%～120% 的要求[37]。以C18为净化剂时，15 种目标化合物的回收率在81%～109%之间，除虱螨脲的基质效应为-30%，表现为中度抑制外，其余目标化合物均表现为轻度基质增强效应，故选用C18作为牛生乳基质的净化剂。

图4 净化剂组合对牛生乳基质提取液中15 种目标化合物回收率 (A) 和基质效应 (B) 的影响 (n = 3)Fig.4 Effects of cleanup sorbents on the recovery (A) and matrix effect (B) of 15 target compounds in matrix extracts of raw milk (n = 3)

2.3.3 C18用量的优化 在其他试验条件一致的情况下，分别考察了20、40、60、80 和100 mg C18对15 种目标化合物在牛生乳中的回收率和基质效应的影响。结果 (图5) 表明：不同用量的C18对15 种目标化合物的平均回收率 (94%～111%)影响不大。但随着C18用量的增加，除抑霉唑、炔草酯和肟菌酯外，其余目标化合物的基质效应均有降低的趋势。当C18用量为100 mg 时，抑霉唑、炔草酯和肟菌酯的基质效应分别为0.10%、3.3%和1.4%，表现为轻度增强基质效应。因此选择C18用量为100 mg。

图5 C18 用量对牛生乳基质提取液中15 种目标化合物回收率 (A) 和基质效应 (B) 的影响(n = 3)Fig.5 Effects of amount of C18 on recovery (A) (n = 3) and matrix effect (B) of 15 target compounds in matrix extract of raw milk (n = 3)

2.4 基质效应

基质是样品中除了被分析物以外的成分，对目标物的影响也不相同，也会对分析方法的线性、灵敏度、精密度和正确度造成干扰，这些影响和干扰被称为基质效应 (ME)[34]。当ME = 0 时，表示无基质效应；当 -20% ≤ ME ≤ 20%时，表示弱基质效应，基质效应可以忽略；当20% ＜ME ≤ 50%或者 -50% ≤ ME ＜ -20%时，表示中度基质增强或者中度基质抑制效应；当ME > 50%或者 ＜ -50%时，表示重度基质增强或重度基质抑制效应。基质效应越接近0，说明净化效果越好[35]。由表3 可知，除虱螨脲属中度基质抑制效应外，其余14 种目标化合物的基质效应范围在-0.50%～11%之间，属于弱基质效应。综合考虑，采用牛生乳基质空白溶液配制标准溶液，外标法定量。

表3 15 种目标化合物的线性方程、决定系数、检出限、定量限和基质效应 (线性范围：0.01～1 mg/L)Table 3 Linearity equations, determination coefficients, limit of detection (LOD) , limit of quantification (LOQ) and matrix effect (ME) of 15 target compounds (Linear range: 0.01-1 mg/L )

2.5 方法确证

2.5.1 灵敏度和线性范围 按本研究建立的前处理方法及仪器测定方法对牛生乳中15 种目标物的线性关系、正确度、精密度、检出限 (LOD) 和定量限(LOQ)进行了考察。结果 (表3) 表明：15 种目标化合物在质量浓度0.01～1 mg/L 范围内，决定系数R2≥ 0.9954。牛生乳中15 种目标化合物的方法LOQ 在0.001～0.01 mg/kg 之间，LOD 在0.0003～0.003 mg/kg 之间，小于CAC[30]和澳大利亚[29]在牛生乳上建立的MRL 值。

2.5.2 正确度和精密度 结果(表4)表明：在牛生乳中添加0.01、0.1 和1 mg/kg 3 个水平的15 种目标化合物，每个水平5 个重复，平均回收率在87%～109%之间，相对标准偏差 (RSD) 在0.30%～11%之间。表明本方法正确度和精密度均可满足农药残留分析的要求[37]。

表4 15 种目标化合物在牛生乳中的添加平均回收率和相对标准偏差Table 4 The average recoveries and relative standard deviations (RSD) of 15 target compounds in raw milk

2.6 实际样品监测

对我国牛生乳主产区 (内蒙古、新疆和宁夏)进行抽检，每地采样10 份，共30 份样本。检测结果表明：有22 份样品中仅检出乙螨唑1 种农药残留，最大为0.0036 mg/kg，其余14 种目标化合物均未检出。

3 结论

本研究对牛生乳中12 种农药及其3 种代谢物的检测方法基于QuEChERS 方法，样品经体积分数为1%的甲酸乙腈提取，NaCl 盐析，涡旋、离心后取上清液，冷冻5 h 后过C18净化，经HPLCMS/MS 测定。结果表明，15 种目标化合物在牛生乳中的基质效应为 -31%～11%，在0.01～1 mg/L线性范围内，决定系数 (R2) ≥0.9954，表明各目标化合物的质量浓度与其对应的色谱峰面积间呈良好的线性关系。在0.01、0.1 和1 mg/kg 添加水平下，15 种目标化合物的平均回收率在87%～109%之间，RSD 在0.30%～11%之间，LOD 为0.0003～0.003 mg/kg，LOQ 为0.001～0.01 mg/kg，满足农药残留分析的要求。本方法简单、快速、灵敏度高，重现性好，可有效去除基质的干扰，实现多种目标化合物的同时快速分析。该研究结果也可为其他动物源性基质中农药残留分析方法的建立提供借鉴，并为我国牛生乳中12 种农药MRL 值的建立及膳食风险评估提供参考。