超高效液相色谱-串联质谱法快速检测人参制品中39 种农药残留

岳伟芊, 张旭桐, 逯忠斌, 侯志广, 李月茹, 逯 洲*,,

(1.吉林农业大学 植物保护学院，长春 130118；2.吉林农业大学 农业农村部参茸产品质量安全风险评估实验室 (长春)，长春 130118 )

人参Panax ginsengC.A.Meyer 是五加科人参属多年生草本植物，具有多种药理活性[1-3]。人参制品是以人参为原料，经过不同的工艺加工炮制而成的。近年来，随着科学技术以及加工工艺的进步，人参制品的种类大大增加，目前主要有生晒参、红参、人参茶、人参蜜片、人参酒、人参口服液、红参膏和人参糖等[4]。人参种植周期一般为4 至6 年，期间易发生多种病虫害，所以农药的施用必不可少。长期用药会导致农药的积累，这也使得人参制品中存在农药残留超标的风险。因此，需要建立适用于多种人参制品的农药多残留检测方法。目前对人参制品中农药多残留检测的研究主要集中于生晒参和红参[5-9]，而有关人参蜜片、人参水煎液、人参功能饮料和人参酒中的农药残留检测则未见相关报道，并且国内外均未对这4 种人参制品中农药的最大残留限量 (MRL)作出规定。

QuEChERS (quick, easy, cheap, effective,rugged, and safe) 法是Anastassiades 等于2003 年提出的一种快速、有效的农药残留样品前处理方法，主要包括乙腈盐析提取、分散固相萃取 (d-SPE) 净化等过程[10]，目前已经广泛应用于农药多残留检测。为了提高净化效果，减少基质共萃物对分析结果的干扰，后续研究采用不同的净化材料对QuEChERS 法进行改进。有报道指出，氧化锆表面具有大量路易斯酸点位，可以吸附脂肪酸等路易斯碱，从而降低基质对分析的干扰[11]。目前，基于氧化锆 (ZrO2) 开发的新型材料如氧化锆改性硅胶 (Z-Sep) 已经成功应用于多种食品的农药残留分析[12-15]。与传统的QuEChERS 法使用的d-SPE 净化相比，新型的磁性固相分散萃取可以通过磁铁快速分离提取液和净化材料，省去了离心步骤，提高净化的效率[16]。超高效液相色谱-串联质谱 (UHPLC-MS/MS) 法具有高灵敏度、高选择性等优点，与高效液相色谱 (HPLC) 法相比，分析时间大大缩短，与气相色谱 (GC) 以及气相色谱-串联质谱 (GC-MS/MS) 法相比，UHPLC-MS/MS不仅所需分析时间更短，而且可以检测不易挥发的以及受热易分解的化合物，现已成为农药残留分析中最为重要的检测手段之一[17-20]。

截至2022 年底，我国已经在人参上登记了43 种农药有效成分[21]。其中，枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌等生物杀菌剂没有规定MRL，一些无机杀菌剂如氢氧化铜和王铜不适用于色谱法分析。因此，本研究选择其中23 种与UHPLCMS/MS 检测适配的农药，并添加了16 种潜在用于人参种植的高效、低毒农药作为检测对象，采用QuEChERS 法快速提取，将Fe3O4-ZrO2首次应用于人参制品样品的净化，结合UHPLC-MS/MS建立了4 种人参制品中39 种农药残留的检测方法，并用所建立的方法对采集的人参制品样品进行了筛查。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-30 超高效液相色谱仪 (日本Shimadzu 公司)；AB Sciex QTRAP4500 串联质谱仪 (美国SCIEX 公司)；Milli-Q 超纯水仪 (美国Millipore 公司)；X1R 型离心机 (美国ThermoFisher 公司)；TECNAI F20 透射电子显微镜 (美国FEI 公司)。

唑菌酯标准品 (98.30%，天津阿尔塔科技有限公司)；烯酰吗啉 (98.70%)、嘧菌酯 (99.50%)、双炔菌酰胺 (99.40%)、咪鲜胺 (98.80%)、嘧霉胺(99.90%)、噻虫啉 (99.68%)、乙霉威 (99.60%)、噻虫嗪 (99.60%)、三唑酮 (98.70%)、腈菌唑 (99.90%)、嘧菌环胺 (99.90%)、氟吡菌胺 (99.30%)、肟菌酯(98.80%)、吡唑醚菌酯 (98.00%)、丙环唑 (99.00%)、三唑磷 (98.90%)、噻虫胺 (99.12%)、溴氰虫酰胺(98.20%)、仲丁灵 (98.70%)、霜灵 (97.60%)、胺苯吡菌酮 (99.60%)、氟唑菌酰胺 (99.00%)、苯醚甲环唑 (99.90%)、精喹禾灵 (99.00%)、精异丙甲草胺 (98.56%)、戊唑醇 (98.50%)、甲霜灵 (99.90%)、多菌灵 (98.60%)、四氯虫酰胺 (98.00%)、霜霉威(98.20%)、氟硅唑 (98.00%)、氟吡菌酰胺 (99.70%)、氟吗啉 (96.50%)、氯虫苯甲酰胺 (97.80%)、异丙噻菌胺 (98.90%)、吡虫啉 (99.00%)、氟啶胺 (99.90%)、咯菌腈 (99.80%) 标准品，均购自英国LGC 公司；Z-Sep 和甲酸铵 (99.995%) (美国Sigma 公司)；氧化锆纳米颗粒 (南京先丰纳米材料科技有限公司)；ZrCl4和FeCl3• 6H2O (上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；FeCl2• 4H2O (上海阿法埃莎化学有限公司)；乙腈 (色谱纯，北京迪科马科技有限公司)；氯化钠和无水硫酸镁 (广东西陇科学股份有限公司)；氨水 (纯度25.0%，北京化工厂)。4 种人参制品样品购买自中国人参主产区吉林省的超市和药材商店。

1.2 仪器条件

色谱条件：Phenomenex Kinetex F5 色谱柱(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)；流动相A 为5 mmol/L的甲酸铵水溶液，流动相B 为乙腈。梯度洗脱程序：0 min，10% B；1.0 min，10% B；6.0 min，65% B；10.0 min，95% B；11.0 min，95% B；11.1 min，10% B；15.0 min，10% B。柱温设置为40 ℃；流速0.3 mL/min；进样体积为2 μL。

质谱条件：电喷雾离子源正离子和负离子扫描模式 (ESI+/ESI-)；多反应监测 (MRM)；离子化电压5500 V (ESI+)/-4500 V (ESI-)；离子源温度550 ℃；气帘气241.3 kPa；喷雾气和辅助加热气310.3 kPa。39 种农药的质谱检测参数如表1 所示。

表1 39 种农药的检测参数Table 1 Detection parameters of 39 pesticides

1.3 样品制备

1.3.1 Fe3O4-ZrO2的合成 在文献方法[22]的基础上合成Fe3O4-ZrO2：将1.585 g FeCl2• 4H2O、3.785 g FeCl3• 6H2O、2.500 g ZrCl4以及160 mL除氧水加入250 mL 三口烧瓶中，在氮气保护条件下，80 ℃磁力搅拌1 h。随后快速加入22.5 mL氨水，在相同条件下继续搅拌1 h。冷却至室温后，用磁铁收集产物并用超纯水洗涤，直到pH 值达到7。最后，将产物置于80 ℃烘箱内6 h，冷却后研磨，保存在干燥器中待用。

1.3.2 人参制品样品的前处理 将人参蜜片在80 ℃下烘干24 h，粉碎，称取5 g (精确至0.01 g) 至50 mL离心管中，加入10 mL 超纯水，涡旋混匀后浸泡30 min；人参功能饮料或人参水煎液量取10.0 mL，置于50 mL 离心管中。向离心管中加入10.0 mL乙腈，2500 r/min 涡旋1 min。随后加入4 g 无水硫酸镁和1 g 氯化钠，涡旋1 min，5000 r/min离心5 min。取1 mL 上清液加入装有净化材料的2 mL 离心管 (人参蜜片和人参水煎液用100 mg Fe3O4-ZrO2净化，人参功能饮料用25 mg Fe3O4-ZrO2净化)，涡旋10 s，使用磁铁磁力收集2 min。取上清液，过0.22 μm 滤膜后待测。

人参酒是有机相和水相的混合物。其中，有机相无法通过盐析与乙腈分层，而水相会被净化材料吸附导致定量结果不准确。因此，人参酒取1 mL 过0.22 μm 滤膜后直接上机，无需其他处理。

1.4 方法验证

称取39 种农药标准品各10 mg，分别加入10 mL乙腈溶解，配制成1000 mg/L 的标准贮备液；使用39 种化合物的标准贮备液配制成20 mg/L 的混合标准溶液。用乙腈或空白基质提取液 (人参蜜片、人参水煎液和人参功能饮料) 以及人参酒的空白基质稀释混合标准溶液，配制成0.005、0.01、0.02、0.05 和0.1 mg/L 的溶剂标准溶液和基质匹配标准溶液。使用1.2 节中的条件检测，以各化合物的质量浓度为横坐标 (x)，定量离子峰面积为纵坐标 (y)，权重为1/x，建立标准曲线。

在0.01、0.1、1 μg/g 3 个添加水平下，对4 种人参制品空白样品进行添加回收试验，每个添加水平重复5 次。由于1 μg/g 添加水平下样品中分析物的浓度超出了基质匹配标准曲线的线性范围，因此，使用空白人参制品提取物将该添加水平的样品稀释10 倍以达到范围内浓度。采用1.3.2节中的方法处理样品，在1.2 节的条件下检测，计算平均回收率和相对标准偏差 (RSD)。

基质效应 (ME) 是由基质共萃物离子化引起的，是UHPLC-MS/MS 分析中影响方法准确度、精密度的重要因素之一。按 (1) 式计算ME。

式中Sm为基质标准曲线斜率，Ss为溶剂标准曲线斜率。当ME > 20% 时为基质增强效应，-20% ≤ ME ≤ 20%时基质效应不明显，当ME ＜-20%时为基质抑制效应[23]。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

使用针泵在10 μL/min 流速下将1.0 mg/L 的39 种标准溶液分别注入质谱，得到每个化合物的母离子以及两个特征定性子离子，以响应最高的子离子作为定量离子。分别优化去簇电压 (DP) 和碰撞能 (CE)，以提高母离子与子离子的响应。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取方法的优化 Lehotay 等在对QuEChERS

法进行验证的过程中发现，在非酸性基质中，一些对碱性pH 敏感的农药回收率较低[24]。为解决此问题，Anastassiades 等又开发了柠檬酸盐缓冲体系将基质的pH 值调节至弱酸性，使对碱性pH 敏感的农药的回收率提高到70%以上[25]。本研究对比了非缓冲QuEChERS 法和柠檬酸盐缓冲QuEChERS法对人参蜜片、人参水煎液以及人参功能饮料中39 种农药提取回收率的影响，结果 (图1) 表明：采用无缓冲QuEChERS 法提取人参蜜片、人参水煎液以及人参功能饮料中39 种农药的回收率分别为73%～101%、75%～109%和74%～94%，RSD 分别为1.5%～12%、2.4%～16%和1.4%～15%；而采用柠檬酸盐缓冲QuEChERS 法提取，相应的农药回收率分别为78%～109%、80%～99% 和71%～91%，RSD 分别为1.8%～14%、1.5%～13% 和0.8%～17%。两种方法均满足农药残留分析标准的要求 (回收率为70%～120%，RSD ≤ 20%)[26]，这可能是由于本方法中包含的农药对提取环境酸碱度不敏感造成的。因此，从节约成本的角度出发，本研究选用无缓冲QuEChERS 法作为提取方法。

图1 不同提取方式从人参水煎液、人参功能饮料、人参蜜片和人参酒中提取39 种农药的回收率(n = 5)Fig.1 Recoveries (n = 5) of 39 pesticides from ginseng decoction, ginseng energy drink, honey ginseng slices and ginseng wine extracted by different methods

2.2.2 净化材料的优化 对合成的产物使用透射电子显微镜 (TEM) 和能量色散X 射线衍射 (EDX)进行表征，结果如图2 所示。图2(a)显示制备的产物呈颗粒状，图2(b)显示产物中含有Fe、O 和Zr，经过测试，所制备的产物具有磁性，上述结果 (图2) 表明本研究成功合成了Fe3O4-ZrO2。

图2 Fe3O4-ZrO2 的表征：(a) 透射电子显微镜图像，(b) 能量色散X 射线衍射图像Fig.2 Characterizations of Fe3O4-ZrO2: (a) transmission electron microscope (TEM) image,(b) energy-dispersive X-ray diffraction (EDX) image

ZrO2中的锆原子含有空的d 轨道，可以作为电子受体吸附脂肪酸和氨基酸等化合物[17,25]。Z-Sep已经作为净化材料广泛应用于农药残留分析。因此，本研究选取了3 种ZrO2材料 (ZrO2纳米颗粒、Z-Sep、Fe3O4-ZrO2) 并对比分析了它们在25、50 和100 mg 3 种用量下的回收率和净化效果。

不同用量下使用Z-Sep 净化人参蜜片、人参水煎液和人参功能饮料提取液，39 种农药在人参蜜片中的回收率分别为63%～93%、69%～90%和72%～95%，在人参水煎液中分别为54%～92%、59%～97%和63%～97%，在人参功能饮料中分别为45%～97%、45%～89%和52%～96%。不同用量下使用ZrO2纳米颗粒净化3 种基质，在人参蜜片中的回收率分别为71%～103%、79%～97% 和77%～93%，在人参水煎液中分别为61%～91%、73%～96%和75%～97%，在人参功能饮料中分别为74%～98%、70%～92%和80%～98%。除霜霉威以外，其余农药回收率均在70%～120%之间。不同用量下使用Fe3O4-ZrO2净化3 种样品，在人参蜜片中的回收率分别为78%～97%、72%～95%和78%～98%，在人参水煎液中分别为71%～96%、72%～93%和77%～95%，人参功能饮料中分别为76%～108%、74%～98%和77%～95%。所有净化材料都提供了良好的回收率。

在获得良好回收率的同时，净化材料应尽可能多的去除基质共萃物。本研究通过高效液相色谱法对比了3 种空白人参制品在不同净化条件下的基质背景。如图3 所示，在相同用量下Fe3O4-ZrO2最大程度地降低了基质背景，对人参水煎液和人参蜜片的净化效果最好，而3 种材料对人参功能饮料的净化效果基本相同，这是因为人参功能饮料中添加的人参成分较少。由于磁性材料的成本优势及快速净化能力，选用Fe3O4-ZrO2净化人参功能饮料。如图4 所示，100 mg Fe3O4-ZrO2对基质背景的去除效果最佳，对人参水煎液和人参蜜片的净化效果最好，而3 种用量对人参功能饮料的净化效果基本相同。ZrO2材料对人参制品提取液的净化能力一方面来自于锆原子上的路易斯酸点位对脂肪酸、氨基酸等路易斯碱的吸附，另一方面可能是因为锆原子与含有羟基、羧基等基团的人参皂苷、挥发油、蛋白质等化合物形成氢键而产生的吸附。3 种ZrO2材料的净化效果不同，可能是因为相同质量下不同材料中锆含量不同所造成的。综上所述，本研究选用100 mg Fe3O4-ZrO2作为人参蜜片和人参水煎液的净化材料，选用25 mg Fe3O4-ZrO2作为人参功能饮料的净化材料。

图3 使用相同用量的不同ZrO2 基材料净化人参水煎液、人参功能饮料和人参蜜片后的基质背景Fig.3 Matrix background of ginseng decoction, ginseng energy drink and honey ginseng slices that cleaned-up by different ZrO2-based sorbents at the same dosage

图4 使用不同用量的Fe3O4-ZrO2 净化人参水煎液、人参功能饮料和人参蜜片后的基质背景Fig.4 Matrix background of ginseng decoction, ginseng energy drink and honey ginseng slices that cleaned-up by different amounts of Fe3O4-ZrO2

2.3 方法评价

2.3.1 线性关系和基质效应 39 种农药在不同基质中的线性回归方程、相关系数 (r) 以及基质效应如表2 所示，在0.005～0.1 mg/L 的浓度范围内，39 种化合物在4 种人参制品中的线性良好，r大于0.99。在人参蜜片、人参功能饮料、人参水煎液和人参酒中分别有72%、36%、8%以及31%的农药存在基质增强或抑制效应，因此采用基质匹配标准曲线进行定量分析。

表2 39 种农药在不同基质中的回归方程、相关系数以及基质效应Table 2 Equations, correlation coefficient (r) and matrix effects (MEs) of 39 pesticides in different matrices

2.3.2 添加回收率和定量限 添加回收试验结果如表3 所示，在0.01、0.1、1 mg/kg 3 个添加水平下，39 种农药在人参蜜片中的平均回收率为72%～117%，RSD 为0.7%～18%；在人参水煎液中的平均回收率为77%～115%，RSD 为0.7%～15%；在人参功能饮料中的平均回收率为74%～104%，RSD 为0.6%～16%；在人参酒中的平均回收率为77%～104%，RSD 为1.0%～16%。本研究以最低添加水平作为方法的定量限 (LOQ)，4 种人参制品基质中39 种农药的LOQ 均为0.01 mg/kg。39 种农药的典型MRM 色谱图如图5所示。

图5 0.01 mg/kg 添加水平下人参蜜片中39 种农药的MRM 色谱图Fig.5 MRM chromatograms of the 39 pesticides at spiking level of 0.01 mg/kg in honey ginseng slices

表3 39 种农药在4 种人参制品中的平均回收率(Rec.)及相对标准偏差(RSDs)Table 3 Average recoveries and relative standard deviations (RSDs) of 39 pesticides in 4 ginseng products

2.4 实际样品检测

用建立的方法对吉林省市场上采集的人参蜜片 (n= 20)、人参水煎液 (n= 20)、人参功能饮料(n= 20) 及人参酒 (n= 20) 进行检测，结果表明，在所有样品中均未检出方法中所含农药的残留。

3 结论

本研究建立了通过UHPLC-MS/MS 快速检测4 种人参制品中39 种农药残留的方法。该方法通过QuChERS 法提取，Fe3O4-ZrO2快速净化。经验证，Fe3O4-ZrO2对样品的净化效果比ZrO2纳米颗粒和Z-Sep 更好，方法的准确度和精密度满足农药残留检测的要求。该方法具有高通量、净化效果好且操作简便的特点，可作为相关农药风险筛查的技术依据。