槭菌刺孢对5 种甾醇脱甲基抑制剂的敏感性

龙月娟, 汤 红,2, 王 勇, 高丽芳, 杨 敏,朱书生, 何霞红, 毛忠顺*,

(1.文山学院 三七医药学院，文山三七研究院，云南 文山 663000；2.云南大学 生态与环境学院，昆明 650500；3.云南农业大学 植物保护学院，农业生物多样性应用技术国家工程研究中心，云南生物资源保护与利用国家重点实验室，昆明 650201；4.西南林业大学 西南山区森林资源保护与利用教育部重点实验室，昆明 650224)

三七Panax notoginseng(Burk) F.H.Chen 为我国传统名贵中药材，在临床、制药、保健等方面被广泛运用[1]。由槭菌刺孢Mycocentrospora acerina(R.Hartig) Deighton 引起的三七圆斑病是三七传统种植过程中出现的重要的叶部病害之一[2]，该病的暴发和流行受环境和气候条件影响，低温、高湿和强光有利于病害的流行，常年发病率为10%～30%，严重时可达80%，甚至毁园[3-4]。传统栽培模式下，对三七圆斑病的田间防控主要以化学防治为主，常用化学杀菌剂有代森锰锌、多菌灵、氟硅唑、戊唑醇、嘧菌酯和苯醚甲环唑等，但农药的长期单一使用，容易诱导病原菌产生抗药性，从而影响防治效果[5-6]。

甾醇脱甲基抑制剂类 (DMIs)杀菌剂由于具有内吸性、高效性、广谱性、持效期长兼保护和治疗的作用等特点，近20 年来，在对由子囊菌、担子菌、白粉菌、锈菌及半知菌等病原真菌引起的植物病害防治方面得到了广泛的应用[7-9]，但该类杀菌剂作用位点单一，随施用时间延长或剂量的增加，容易导致病原菌产生抗性。多种植物病原菌已对甾醇脱甲基抑制剂表现出敏感性降低或产生了抗性菌株，如检测到了苹果轮纹病菌Botryosphaeria dothidea对苯醚甲环唑和氟硅唑敏感性降低的亚群体[10]、在草坪草币斑病菌Sclerotinia homoeocarpa上检测对到丙环唑敏感性下降的亚群体[11]、在核桃炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides上检测到了对戊唑醇敏感性显著下降的抗性菌株[12]。此外，在小麦赤霉病菌Fusarium graminearum群体中存在对戊唑醇有抗性的菌株[13]，并且在近年来的敏感性监测中发现，小麦赤霉病菌对叶菌唑和戊唑醇的敏感性显著低于2000 年以前的分离株的敏感性[14]。

苯醚甲环唑、戊唑醇、丙环唑等DMIs 杀菌剂已被广泛应用于三七圆斑病、三七黑斑病、三七根腐病等三七病害的防治，且为使用频率较高的农药种类之一[15]，目前尚未见关于槭菌刺孢对DMIs 杀菌剂敏感性的研究报道。本研究拟采用菌丝生长速率法测定从云南省3 个三七种植区分离的槭菌刺孢对丙环唑、戊唑醇、烯唑醇、氟硅唑和苯醚甲环唑5 种常用DIMs 杀菌剂的敏感性，以期明确其敏感性分布，分析不同地区槭菌刺孢对上述5 种杀菌剂的敏感性差异和病菌对不同杀菌剂的敏感性之间的交互抗性，以监测病原菌对三唑类杀菌剂的敏感性，为合理利用DIMs 杀菌剂防治三七圆斑病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株 2015—2019 年，从云南省文山州、红河州、昆明3 个地区的8 个三七规模化种植基地采集具有典型三七圆斑病症状的病样，采用常规组织分离法进行病原菌分离与单孢纯化[16]，所得的单孢菌株经过形态学鉴定、ITS 序列分析及致病性测定，共获得45 株槭菌刺孢M.acerina，并将其采用斜面保存法于4 ℃冰箱中保存备用。

1.1.2 供试药剂 95.1%氟硅唑原药 (flusilazole，美国杜邦公司)、95%苯醚甲环唑原药 (difenoconazole，宁波三江益农化学有限公司)、99% 烯唑醇原药(diniconazole，江苏常隆农化有限公司)、96%丙环唑原药 (propiconazole，浙江禾本科技有限公司)和97%戊唑醇 (tebuconazole，广西田园生化股份有限公司) ，由云南农业大学植物病理学重点实验室提供。以丙酮溶解，分别配制成质量浓度为1 ×104μg/mL 的母液，以含无菌1%吐温-80 溶液稀释为系列浓度，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 槭菌刺孢对不同杀菌剂的敏感性测定 采用菌丝生长速率法[17]，将供试菌株在无菌PDA 平板上20 ℃光照培养7 d，从菌落边缘打取直径5 mm 菌饼，分别接种在质量浓度分别为0.01、0.10、0.50、1.00 和5.00 μg/mL 含药PDA 培养基中央，以不含药剂的PDA 培养基为对照，每个浓度处理重复5 次。置于20 ℃光照培养7 d，采用十字交叉法测量菌落直径，每处理取平均值，按公式 (1)计算菌丝在不同浓度药剂处理下的生长抑制率(I)。将抑制率转化为几率值，利用DPS V7.05 数据分析软件计算出不同杀菌剂对应的抑制菌丝生长的毒力回归方程、相关系数以及对槭菌刺孢的抑制中浓度 (EC50值，μg/mL)。

式中：D0为对照菌落直径，cm；Dt为处理菌落直径，cm；Dd为菌饼直径，cm。

1.2.2 敏感性分布图绘制 根据1.2.1 节中的敏感性测定结果，将45 个供试菌株群体对供试药剂的敏感性从高到低依次分为几个不同区间，统计EC50值在各区间中的菌株数占总群体数的频率 (%)，计算出其占整个群体的频率(%)，以菌株EC50值为x轴，相应敏感性频率为y轴，绘制槭菌刺孢对不同供试药剂的敏感性频率分布图，利用SPSS 22.0 软件对1.2.2 节中所得敏感性频率分布分别进行Shapiro-Wilk 正态分布检验。

1.2.3 不同地区槭菌刺孢菌株对5 种杀菌剂的敏感性分布频率 按照EC50值从0～0.5、≥ 0.5～1.5、≥ 1.5～2.5、≥ 2.5～3.5、≥ 3.5～4.5、≥ 4.5～5.5及≥ 5.5 μg/mL 为区间，划分不同三七种植区槭菌刺孢在不同区间的分布频率，进行不同地区45 株槭菌刺孢对5 种杀菌剂的敏感性比较。

1.2.4 交互抗性分析 通过Spearman’s 秩相关系数，分析45 株槭菌刺孢对5 种杀菌剂的交互抗性。根据不同杀菌剂对供试菌株的EC50值浓度对数之间的决定系数 (R2)、b值及F检验的显著水平(P值)，分析判断各杀菌剂之间的交互抗性关系[18-20]。

2 结果与分析

2.1 45 株槭菌刺孢对5 种杀菌剂的敏感性分析

敏感性测定结果表明，氟硅唑对供试菌株的EC50值在0.04～3.81 μg/mL 之间，平均值为 (1.20 ±0.92) μg/mL，最大值为最小值的95.33 倍；苯醚甲环唑的EC50值在0.18～6.72 μg/mL 之间，平均值为 (1.95 ± 1.27) μg/mL，最大值为最小值的37.33 倍；烯唑醇的EC50值在0.08～7.75 μg/mL之间，平均值为 (2.49 ± 1.59) μg/mL，最大值为最小值的96.88 倍；丙环唑的EC50值介于0.44～11.38 μg/mL 之间，平均值为 (2.81 ± 1.96) μg/mL，最大EC50值为最小值的25.86 倍；戊唑醇的EC50值在0.46～29.85 μg/mL 之间，平均值为 (4.77 ±5.98) μg/mL，最大值为最小值的64.89 倍。根据上述结果可知，5 种杀菌剂中，病原菌对戊唑醇最不敏感。

分别将5 种杀菌剂对45 个菌株的EC50值，设置相应的截距将其分成不同区间，统计每个区间的菌株数和占总群体频率 (图1)。通过SPSS 26.0 对其分别进行Shapiro-Wilk 正态性检验，结果显示，氟硅唑 (W= 0.89，P＜ 0.05)、苯醚甲环唑 (W= 0.90，P＜ 0.05)、烯唑醇 (W= 0.93，P＜0.05)、丙环唑 (W= 0.85，P＜ 0.05) 和戊唑醇 (W=0.53，P＜ 0.05) 的敏感性频率分布均不符合正态分布，表明供试菌株对5 种杀菌剂的敏感性均出现了一定的分化，少数菌株出现敏感性降低的现象。

图1 槭菌刺孢对氟硅唑、苯醚甲环唑、烯唑醇、丙环唑及戊唑醇的敏感性频率分布Fig.1 The frequency distribution of the sensitivity of M. acerina populations to flusilazole, difenoconazole,diniconazole, propiconazole and tebuconazole

根据上述敏感性分析结果，供试菌株对氟硅唑、苯醚甲环唑、烯唑醇、丙环唑及戊唑醇的敏感性已出现一定的分化，但仍有91.11%、95.56%、97.78%、97.78%和91.11%的菌株位于图1 中相应主峰范围内，其敏感性频率基本呈连续性分布，对这部分菌株利用SPSS 进行Shapiro-Wilk 正态性检验，结果显示，供试45 个菌株群体对氟硅唑 (W= 0.95，P= 0.07 > 0.05)、苯醚甲环唑 (W=0.96，P= 0.13 > 0.05)、烯唑醇 (W= 0.95，P=0.06 > 0.05)、丙环唑 (W= 0.96，P= 0.13 > 0.05)和戊唑醇 (W= 0.96，P= 0.20 > 0.05) 的敏感性频率分布呈近似正态分布，平均EC50值分别为(0.99 ± 0.64)、(1.77 ± 0.97)、(2.37 ± 1.39)、(2.61 ±1.48) 和 (3.18 ± 1.58) μg/mL。

2.2 不同地区槭菌刺孢菌株对5 种杀菌剂的敏感性分布

由表1 可知，来自云南省3 个地区的菌株对5 种杀菌剂的敏感性存在差异。其中，文山州的菌株对氟硅唑和苯醚甲环唑最为敏感，两种杀菌剂对该地区菌株EC50值均小于3.5 μg/mL；烯唑醇、丙环唑和戊唑醇对该地区菌株EC50值大于5.5 μg/mL 的菌株频率分别为6.3%、6.3%及25%。红河州的菌株对氟硅唑最为敏感，氟硅唑对该地区菌株EC50值均小于3.5 μg/mL；红河州菌株对丙环唑和戊唑醇最不敏感，丙环唑和戊唑醇对该地区菌株EC50值大于5.5 μg/mL 的菌株频率为分别为5.3%和10.5%。昆明地区的菌株对氟硅唑和丙环唑较为敏感，两种杀菌剂对该地区菌株EC50值小于3.5 μg/mL 的菌株频率为90%，苯醚甲环唑、烯唑醇及戊唑醇对该地区菌株的EC50值大于5.5 μg/mL 的菌株频率分别为10%、10%和20%。总体来说，分离自文山州、红河州及昆明地区的菌株均对氟硅唑最为敏感，而对苯醚甲环唑、烯唑醇及丙环唑的敏感性有不同程度的分化，除文山州菌株对苯醚甲环唑的敏感性较强外，已出现烯唑醇对文山州和昆明地区菌株以及丙环唑对文山州和红河州菌株EC50值大于5.5 μg/mL 的菌株群体；3 个地区的菌株对戊唑醇均最不敏感，均分化出了EC50值大于5.5 μg/mL 的菌株群体。

表1 云南省3 个地区槭菌刺孢对氟硅唑、苯醚甲环唑、烯唑醇、丙环唑和戊唑醇的敏感性分布Table 1 Sensitivity frequency distribution of M. acerina strains isolated from three areas in Yunnan Province to flusilazole,difenoconazole, diniconazole, propiconazole and tebuconazole

2.3 槭菌刺孢对5 种杀菌剂敏感性的相关性分析

根据相关性分析结果 (图2) 显示，供试菌株对氟硅唑和苯醚甲环唑的敏感性群体相关性最高，其相关系数 (r) 为0.989 (P＜ 0.01)，其余依次为苯醚甲环唑和丙环唑 (r= 0.988)、氟硅唑和烯唑醇 (r= 0.985)、苯醚甲环唑与烯唑醇 (r= 0.973)、氟硅唑和丙环唑 (r= 0.969)、烯唑醇和丙环唑 (r=0.955)、丙环唑和戊唑醇 (r= 0.943)、苯醚甲环唑和戊唑醇 (r= 0.940)、氟硅唑和戊唑醇 (r= 0.928)以及烯唑醇和戊唑醇 (r= 0.915)，以上F检验的显著性水平P值均 ＜ 0.01，因此供试菌株对丙环唑、戊唑醇、烯唑醇、氟硅唑和苯醚甲环唑的敏感性均存在极显著正相关性，表明槭菌刺孢对这5 种杀菌剂均存在显著的交互抗性，其中对氟硅唑和苯醚甲环唑的交互抗性最强。

图2 槭菌刺孢对氟硅唑、苯醚甲环唑、烯唑醇、丙环唑和戊唑醇的交互抗性Fig.2 Cross-resistance of M. acerina to flusilazole, difenoconazole, diniconazole, propiconazole and tebuconazole

3 小结与讨论

自20 世纪70 年代以来，由于DMIs 杀菌剂在田间较好的防治效果，故已成为杀菌剂研制和应用的主流[21]，如甲康唑、丙硫菌唑和戊唑醇的混合施用有效降低了小麦赤霉病的病情指数，并减少了该病原产生的脱氧雪腐镰刀醇 (DON) 毒素[22]；戊唑醇、烯唑醇及苯醚甲环唑等杀菌剂能够防治小麦纹枯病[23]；苯醚甲环唑可有效抑制苹果腐烂病菌菌丝生长及分生孢子萌发[24]；施用10%苯醚甲环唑水分散粒剂 (有效成分66.7 mg/kg)和400 g/L 氟硅唑乳油 (有效成分57.1 mg/kg) 对苹果轮纹病的田间防效均达到70%以上[8,10]；施用1%粉唑醇颗粒剂 (有效成分749.62 g/hm2) 对小麦纹枯病的田间防效高达100%[25]等。虽然现阶段我国生产上登记的用于防治三七圆斑病的药剂只有6%春雷霉素可湿性粉剂和50%唑醚 • 喹啉铜水分散粒剂两种，然而生产实践中施用的农药多达50 余种。DMIs 杀菌剂是三七病害防治常用的种类，如氟硅唑、烯唑醇、苯醚甲环唑、戊唑醇和丙环唑等[15,26-28]。由于杀菌剂的不合理或单一频繁使用，增加了其病原菌抗药性风险，其原因主要有自然选择和诱导突变两种观点[29]。DMIs 杀菌剂作用位点单一，若使用不当易使病原菌产生抗性。有研究表明，点突变与病原菌对DMIs 杀菌剂的抗性有关。许多植物病原体对DMIs 杀菌剂的抗药性具有数量遗传性状，其特征是病原菌群体对药剂的敏感性逐渐降低甚至转变为不敏感[30]。DMIs 杀菌剂主要作用于真菌甾醇生物合成中的14α-脱甲基酶 (CYP51)，通过抑制真菌细胞膜中麦角甾醇的合成达到抑菌作用[31-33]，而CYP51 氨基酸突变是植物病原真菌中报道较多的抗性机制[34]，例如小麦叶枯病菌Mycosphaerella graminicola[35-36]、水稻纹枯病菌Rhizocotonia solani[37]、烟曲霉Aspergillus fumigatus[38]及大豆胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides[39]等许多植物病原真菌对DMIs 类杀菌剂的抗药性都是由CYP51 氨基酸点突变引起。监测病原菌对药剂的敏感性是预防产生抗性风险的一种方法[40-42]。目前已在苹果轮纹病菌Botryosphaeria dothidea[43]、大蒜紫斑病菌Alternaria alternata[44]、水稻纹枯病菌[30]及甜菜尾孢菌Cercospora beticola[45]等病原菌上陆续检测到对DMIs 类杀菌剂高抗菌株，目前三唑类杀菌剂已被国际杀菌剂抗性行动委员会(Fungicide Resistance Action Committee) 列入中等抗药风险杀菌剂[46]。

本研究中分离自云南省3 个地区的45 株槭菌刺孢对氟硅唑、苯醚甲环唑、烯唑醇、丙环唑及戊唑醇5 种DMIs 杀菌剂敏感性频率分布均不符合正态分布，敏感性均呈现不同程度的分化，大部分菌株位于相应主峰范围内，其敏感性频率基本呈连续性正态分布，表明5 种DMIs 杀菌剂总体对病原菌的抑制效果较好，但存在敏感性降低的菌株亚群体，如检出不在其正态分布范围内的部分菌株最大EC50值分别为3.81、6.72、7.75、11.38 及29.84 μg/mL (该值分别为其相应呈连续正态分布主峰内平均EC50值的4、4、3、4 及9 倍)；王慧玲等发现，来自红河、澜沧、昆明及文山等4 个地区的34 株槭菌刺孢均对苯醚甲环唑表现出较为敏感，其对91.17%的菌株EC50值主要分布在0.5～1.05 μg/mL 之间[27]，而在本研究中苯醚甲环唑对95.56%菌株的EC50值主要分布在0.18～3.67 μg/mL，此部分菌株疑似出现敏感性下降，说明其对DMIs 杀菌剂存在一定的抗性风险。本研究中供试菌株对氟硅唑的敏感性均高于对其他4 种杀菌剂，其中来自文山州的菌株对氟硅唑的敏感性明显高于红河州和昆明地区的菌株；而与其他4 种杀菌剂相比，供试菌株均对戊唑醇最不敏感，均出现敏感性下降的群体。本研究中不同地区间菌株的敏感性差异可能与不同种植区域既往的用药历史及用药频率有关，是否存在抗药性菌株还有待进一步研究。目前未见槭菌刺孢对氟硅唑、烯唑醇、丙环唑及戊唑醇敏感性的相关研究报道, 本研究的敏感性分布可作为今后5 种杀菌剂的田间抗药监测方案的参考依据。

DMIs 杀菌剂主要包括三唑类、咪唑类、嘧啶类、吡啶类和哌嗪类[47]，本研究开展了槭菌刺孢对5 种三唑类杀菌剂的敏感性的初步研究，基于课题组调查发现，实际生产中常混用DMIs 同类杀菌剂或长期使用同种杀菌剂的现象，而通常情况下同类杀菌剂之间会存在交互抗性[48]。在关于三唑类杀菌剂的交互抗性研究中，叶滔等认为禾谷镰孢菌F.graminearum对戊唑醇和苯醚甲环唑之间不存在交互抗性[49]；刘保友等发现，苹果轮纹病菌B.dothidea对苯醚甲环唑、氟硅唑及戊唑醇之间具有交互抗性[10]；Mao 发现，水稻恶苗病的致病菌藤仓镰孢菌F.fujikuroi对咪鲜胺的抗性是由FfCyp51B与Cyp51A协同作用引起的，仅对丙硫菌唑产生交互抗性，而对戊唑醇、苯醚甲环唑、丙环唑、叶菌唑、己唑醇和三唑酮无交互抗性[50]。本研究中槭菌刺孢对氟硅唑、苯醚甲环唑、烯唑醇、丙环唑和戊唑醇这5 种杀菌剂之间的相关系数较高，两两间均存在较强的正交互抗性。同类DMIs 杀菌剂的混合施用可能增加病原菌抗药性风险，因此三七圆斑病菌槭菌刺孢对其他种类杀菌剂的敏感性、交互抗性关系及其交互抗性机制还需进一步研究。