乳腺癌组织中泛素特异性蛋白酶18/干扰素刺激基因15表达水平及其临床意义

蔡冰，尹香利，刘静

乳腺癌发病率呈逐年增高趋势，对女性生存质量造成严重影响［1］。泛素特异性蛋白酶18（USP18）在喉鳞状细胞癌组织中呈过表达，其有助于评估喉鳞状细胞癌预后情况［2］；干扰素刺激基因15（interfer‑on stimulated gene 15，ISG15）在乳腺癌组织中表达上调，其可能是诊治乳腺癌的潜在靶标［3］；且USP18 可将ISG15从其靶向蛋白上水解出来，进而在调控细胞多种信号途径中发挥作用［4］。但USP18 在乳腺癌病人癌组织中的表达水平与ISG15的相关性及与乳腺癌预后的关系尚未明确。基于此，本研究通过Ual‑can 数据库检索USP18、ISG15 在乳腺癌中的表达情况及二者与乳腺癌预后的关系，并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法、免疫组化法检测乳腺癌病人癌组织USP18、ISG15 表达水平，旨在分析USP18、ISG15相关性及两者与预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2012 年5 月至2015 年7 月于渭南市中心医院行根治性切除术的乳腺癌病人99例为研究对象，均为女性，年龄（49.28±10.22）岁，范围为35~65 岁，<50 岁者53 例，≥50 岁者46 例；肿瘤长径<2 cm 者48 例，≥2 cm 者51 例；TNM 分期Ⅰ~Ⅱ期者66例，Ⅲ~Ⅳ期者33例；绝经者40例，未绝经者59 例；无淋巴结转移者64 例，淋巴结转移者35 例；低分化者25 例，中、高分化者74 例。根据文献［5］及雌激素受体（ER）、表皮生长因子受体-2（HER-2）、孕激素受体（PR）免疫组化检测结果将乳腺癌病人分为Luminal A 型（PR+或ER+、HER-2-）41 例、HER-2过表达型（PR-、ER-、HER-2+）20 例、Luminal B 型（PR+或ER+、HER-2+）23 例、基底细胞样型（PR-、ER-、HER-2-）15例。

诊断标准：参考《乳腺癌诊疗规范（2011 年版）》［6］有关乳腺癌判定标准进行诊断。纳入标准：（1）受试者术后组织样本经病理学检查确诊为浸润性乳腺癌；（2）受试者均行腹部和妇科B 超等检查，检查资料齐全；（3）受试者术前未接受放化疗、内分泌治疗或其他治疗。排除标准：（1）合并胃癌、前列腺癌或其他肿瘤者；（2）合并高血压、急慢性感染、严重心、肝、肾功能不全、糖尿病者；（3）病理诊断不明确或失访者。

受试对象对本研究知情同意，获得渭南市中心医院伦理委员会批准（批号201204152）。

1.2 方法

1.2.1Ualcan 数据库检索 利用Ualcan 数据库（http：//ualcan.path.uab.edu）检索USP18、ISG15 表达水平及二者与预后的关系。gene symbol 设置为USP18、ISG15，TCGA 数据集设定为breast invasive carcinoma，进行检索。

1.2.2组织标本收集 取乳腺癌病人在根治性切除术中切除的组织标本（乳腺癌组织和距离癌组织>3 cm 的癌旁正常组织），液氮罐中冻存24 h，移至-80 ℃冰箱中冻存；剩余部分组织标本放置于福尔马林中固定，用于制备石蜡标本切片。

1.2.3qRT-PCR 法检测组织标本USP18、ISG15 mRNA 表达水平 取出“1.2.1”中冻存的标本，研碎，利用TRIzol试剂盒（无锡百泰克生物技术有限公司）提取标本总RNA，应用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（K1622，上海恒斐生物科技有限公司）将组织标本RNA 反转录成cDNA。依照Perfectstart SYBR Green qPCR master mix 试剂盒（TQ2300-02，北京索莱宝科技有限公司）说明书配制反应体系，运用qRT-PCR 仪（ABI7500，上海普迪生物技术有限公司）进行扩增、检测。以2-∆∆Ct法计算USP18、ISG15 mRNA 相对表达量。USP18、ISG15 均以GAPDH 为内参，引物序列详见表1。

表1 USP18、ISG15、GAPDH引物序列

1.2.4免疫组化法检测组织标本USP18、ISG15蛋白表达水平 取石蜡标本切片（厚约4 µm），利用链霉亲和素-生物素复合物法染色，参考相关试剂盒说明书进行操作，一抗分别为兔抗人USP18 多克隆抗体（上海群己生物科技有限公司，批号H00011274-B01，稀释比为1∶100）、ISG15多克隆抗体（艾美捷科技有限公司，批号A71120-100，稀释比为1∶100），应用二氨基联苯胺显色、苏木素复染、梯度乙醇脱水，封片，显微镜（DMi1，上海徕卡显微系统贸易有限公司）下拍照。按染色程度（A）和阳性细胞比例（B）评分乘积判定USP18、ISG15蛋白表达情况：（1）染色程度：将无色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别定义为0、1、2、3 分；（2）阳性细胞百分比：将<25%、25%~49%、50%~75%、>75%分别定义为0、1、2、3分。判定结果（A×B）：<3分定义为阴性，以≥3分定义为阳性［7］。

1.3 随访对99例乳腺癌病人术后进行9~60个月随访，以院内复查、微信为主要随访方式，以乳腺癌病人手术次日为随访起点，2020 年7 月或乳腺癌病人死亡为随访终点，记录乳腺癌病人预后生存状况。

1.4 统计学方法运用SPSS 25.0 软件处理数据。以±s表示连续变量资料，组间比较行独立样本t检验；以例（%）表示计数资料，乳腺癌组织USP18、ISG15表达水平与临床病理特征关系进行χ2检验；乳腺癌病人组织中USP18、ISG15蛋白表达情况及乳腺癌病人癌组织中USP18 表达水平与ISG15 相关性进行χ2检验；利用Kaplan-Meier曲线及log-rank检验分析乳腺癌组织USP18、ISG15表达水平与乳腺癌病人预后的关系；Cox回归分析法分析乳腺癌病人预后的影响因素。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ualcan 数据库中乳腺癌组织和正常乳腺组织USP18、ISG15 mRNA 表达水平比较Ualcan 数据库中，乳腺癌组织USP18 为18.40±4.17、ISG15 mRNA 表达水平为168.56±43.95，均高于正常乳腺组织（10.00±3.14、30.76±8.23，P<0.001）。

2.2 乳腺癌、癌旁正常组织中USP18、ISG15 mRNA 及其蛋白表达水平比较与癌旁正常组织相比，乳腺癌组织USP18、ISG15 mRNA 表达水平显著升高，分别为癌旁正常组织的1.62、1.88 倍（P<0.05）。免疫组化结果显示，USP、ISG15 均主要定位于细胞质，如图1 所示。乳腺癌组织USP18、ISG15阳性表达率均高于癌旁正常组织，分别为癌旁正常组织的3.38、2.11倍。见表2。

图1 USP18、ISG15蛋白在乳腺癌组织及癌旁正常组织中的典型表达病理示例（链霉亲合素-生物素复合物法×200）

表2 乳腺癌病人99例乳腺癌组织、癌旁正常组织USP18、ISG15 mRNA及其蛋白表达水平比较

2.3 乳腺癌组织USP18、ISG15 表达水平与临床病理特征关系乳腺癌组织USP18、ISG15 表达水平均与淋巴结转移、乳腺癌分子亚型、肿瘤分化程度、TNM 分期相关（P<0.05），而与年龄、肿瘤长径、是否绝经无关（P>0.05）。见表3。

表3 乳腺癌组织USP18、ISG15表达水平与临床病理特征关系/例（%）

2.4 乳腺癌病人癌组织USP18 表达水平与ISG15的相关性配对χ2检验显示，乳腺癌病人癌组织中USP18 表达水平与ISG15 呈正相关（P<0.05）。见表4。

表4 乳腺癌病人癌组织中USP18表达水平与ISG15相关性/例

2.5 Ualcan 数据库中癌组织USP18、ISG15 表达水平与乳腺癌病人预后的关系Ualcan 数据库分析显示，癌组织USP18、ISG1 高低表达组累积生存率［21.89%（58/265）比36.89%（301/816）、22.10%（59/267）比36.98%（301/814）］差异无统计学意义（P>0.05）。

2.6 癌组织USP18、ISG15 表达水平与乳腺癌病人预后的关系跟踪随访99 例乳腺癌病人9~60 个月，死亡23 例，总生存率为76.77%。Kaplan-Meier生存分析显示，USP18 阳性组乳腺癌病人平均生存时间为50.61 个月，95%CI：（46.57，54.66），短于USP18 阴性组平均生存时间为57.56 个月，95%CI：（35.05，60.06），log-rank 检验比较USP18 阳性组与USP18 阴性组生存率，差异有统计学意义（χ2=9.24，P=0.002）；ISG15 阳性组平均生存时间为50.92 个月，95%CI：（47.12，54.71），短于ISG15 阴性组平均生存时间为57.98 个月，95%CI：（55.44，60.51），经Log-Rank 检验结果显示，ISG15 阳性组、阴性组生存率差异有统计学意义（χ2=8.97，P=0.003）。

2.7 Cox 回归分析乳腺癌病人预后的影响因素单因素Cox分析显示，淋巴结转移、乳腺癌分子亚型（哑变量赋值：Luminal A 型、Luminal B 型、HER-2 过表达型、基底细胞样型分别赋值为0、1、2、3）中HER-2过表达型、基底细胞样型、TNM 分期、USP18、ISG15 是影响乳腺癌病人不良预后的危险因素（P<0.05），分化程度是影响乳腺癌病人预后的保护因素（P<0.05）；多因素Cox 分析结果显示，淋巴结转移、TNM 分期、USP18、ISG15 均是影响乳腺癌病人不良预后的独立危险因素（P<0.05）。见表5。

表5 影响乳腺癌病人预后因素的Cox回归分析

3 讨论

乳腺癌是多发于女性乳房腺上皮组织的妇科肿瘤，发病率较高，直接威胁女性生存情况［8］。因此，寻找与乳腺癌发病及预后有关的指标，给予合适干预，对改善女性病人生存状况有一定积极意义。

USP18 是泛素系统成员之一，其可介导蛋白泛素化，调控多种信号途径，影响细胞增殖、凋亡等生物学过程［9-10］。研究发现，USP18在结直肠癌中呈高表达，其可能通过泛素化途径调控Snail1蛋白表达，进而促进结直肠癌细胞增殖、侵袭、迁移，从而在结直肠癌病理发展中起促进作用［11］。此外，Tan 等［12］通过基因富集分析、生物信息学分析发现USP18 可能与乳腺癌病人癌细胞凋亡呈负相关、与乳腺癌病人不良预后关系密切，USP18 可能通过激活有关途径，并上调表皮生长因子受体进而在乳腺癌发展中发挥重要作用。本研究显示，乳腺癌病人癌组织中USP18 蛋白阳性表达率、USP18 mRNA 表达水平较高，与Tan 等［12］研究结果及Ualcan 数据库检索结果相符，且乳腺癌组织USP18 表达水平与淋巴结转移、乳腺癌分子亚型、肿瘤分化程度、TNM 分期相关，提示USP18 表达异常可能与乳腺癌分子亚型、病变进程有关，USP18 可能是治疗乳腺癌的潜在靶标，测定癌组织USP18 表达情况有助于临床制定较为精准的个体治疗方案，推测高表达USP18 可能通过泛素化途径调节多种蛋白异常表达，促进乳腺癌细胞异常增殖、转移，影响其凋亡，从而促进乳腺癌病情进展［13］。

ISG15 是一种类泛素蛋白，其能通过酶级联反应修饰靶蛋白，调节蛋白活性，参与转录调控、染色体修复、应激反应、RNA 剪接、蛋白质翻译等过程［14-16］。研究发现，ISG15在乳腺癌细胞中表达水平显著升高，其可能参与乳腺癌发展进程，ISG15 可能是乳腺癌发生转移的关键标志物［17］；另外，王军武等［18］发现ISG15在乳腺癌病人中呈高表达，ISG15可作为评估乳腺癌病人病情的潜在指标。本研究中，乳腺癌病人癌组织中ISG15 蛋白阳性表达率、ISG15 mRNA 表达水平较高，与Ualcan 数据库检索结果一致，ISG15阳性表达率随淋巴结转移、TNM 分期升高/分化程度降低而呈升高趋势，且与乳腺癌分子亚型有关，提示ISG15 可能与乳腺癌病变进展及不同分子亚型乳腺癌显著相关，检测癌组织ISG15表达水平有利于判定乳腺癌分子亚型，制定有效的干预方案，究其原因，高水平ISG15可能通过修饰靶蛋白，影响有关信号通路，调节相关蛋白表达，从而影响乳腺癌病变过程［19］。此外，本研究显示，乳腺癌病人癌组织中USP18 表达水平与ISG15 呈正相关，提示USP18 可能与ISG15 共同影响乳腺癌发生发展，可能原因，USP18 可影响ISG15 水平，进而影响乳腺癌进程。进一步研究显示，USP18 阳性组、ISG15 阳性组乳腺癌病人术后60 个月生存率低于USP18 阴性组、ISG15 阴性组，提示癌组织USP18、ISG15 表达水平均与乳腺癌病人不良预后关系密切，USP18、ISG15表达水平越高，乳腺癌病人预后可能越差，USP18、ISG15 可辅助评估乳腺癌病人预后情况，但本研究与Ualcan 数据库检索结果并不一致，这可能与个体差异、分组情况、随访年限有关，后期将扩大样本、延长随访年限，确定本研究的准确性。Cox分析结果显示，淋巴结发生转移、TNM 分期越高、USP18、ISG15 表达水平升高均可能提高乳腺癌病人发生不良预后风险，及时检测乳腺癌组织USP18、ISG15表达情况可能有利于及早评估乳腺癌病人预后状况。

综上，USP18、ISG15 在乳腺癌病人癌组织均表达上调，两者均与乳腺癌病人预后有关，测定癌组织USP18、ISG15 水平有利于临床判断乳腺癌病人病情、评估乳腺癌病人预后。本研究创新点在于：利用Ualcan数据库分析了USP18、ISG15在乳腺癌中的表达情况，并从mRNA 水平（qRT-PCR）和蛋白水平（免疫组化）验证了USP18、ISG15 在乳腺癌中的表达情况，初步分析了USP18、ISG15间的相关性，及二者与乳腺癌临床病理特征及预后的关系，为临床评估乳腺癌病人病情及预后提供参考，但存在一定局限性，后期将进一步扩大样本量分析不同分子分型中ISG15、USP18与临床特征及预后的关系。