中药金贯蓝提取物对寻常痤疮相关致病菌的体外抑菌作用

万春梅，石春蕊，廖蓓，魏玉辉，高军，张剑虹

寻常痤疮（acne vulgaris， AV）是一种常见的以毛囊皮脂腺为单位的慢性炎症性皮肤病［1］。目前公认四大因素与AV 致病高度相关：毛囊皮脂腺角化过度、皮脂溢出、痤疮致病相关微生物的繁殖及继发的免疫炎症反应［2］。其中，痤疮丙酸杆菌（Cuti⁃bacterium acnes或Propionibacteriumacnes， C. acnes或P. acnes）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermi⁃dis， S. epidermidis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococ⁃cus aureus， S. aureus）为代表的痤疮相关致病菌的增殖，可能在AV致病中发挥重要作用［2-4］。

针对AV 致病菌及炎症反应，抗生素治疗是重要治疗手段之一。然而，抗生素的广泛使用导致细菌耐药性形成和耐药菌株的传播［5］。因此，安全有效治疗AV 仍然是我们亟须解决的难题，许多研究者尝试寻找新的替代治疗来解决该问题。既往相关研究报道很多中草药具有较好的抗菌活性，它们安全无毒、价格低廉且不易产生耐药性，对AV 具有潜在治疗价值［6-8］。

金贯蓝提取物是兰州大学第一医院药剂科魏玉辉主任根据中医的“君臣佐使”配伍原则，将五味传统中草药（金银花、贯众、板蓝根、甘草、黄芪）经优化配比制定的医院协定方剂。既往已有大量文献报道金银花、板蓝根、甘草、贯众、黄芪均有不同程度抑菌活性［9-12］。我们推测金贯蓝提取物可能对AV 有一定的治疗价值，但目前中草药抑菌作用相关研究多选用单味药，复方中草药提取物的研究较少。本研究开展体外实验评价金贯蓝提取物对AV相关病原菌的体外抗菌活性，为该新药开发和临床应用提供一定实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 药材实验组药物：中药复方“金贯蓝”为兰州大学第一医院协定组方，由金银花（河南，批号200601）、贯众（吉林，批号200202）、板蓝根（甘肃，批号200501）、黄芪（甘肃，批号191001）、甘草（甘肃，批号200303）五味中药组成，以上药材均购于甘肃陇脉药材有限公司。金贯蓝提取物是由金银花、贯众、板蓝根、黄芪、甘草按照质量最佳比例为1∶1∶1∶3∶1 提取组成，生药浓度为1 g/mL，提取率为28.7%。

阳性对照药：红霉素（批号C11119014）、克林霉素（批号C11860980）、夫西地酸钠（批号C12052162）均购于上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 菌株C. acnes标准菌株（ATCC6919），上海富祥科技有限公司；S. epidermidis标准菌株（ATCC12228）和S. aureus标准菌株（SAU Newman）由兰州大学基础医学院菌种保藏中心提供。

1.3 仪器与设备宝特ELx800 酶标仪（济南奥诺生物工程有限公司）；紫外线可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；真空冷冻干燥机（上海般诺生物科技有限公司）；振荡培养箱（上海旻泉仪器有限公司）；生化培养箱（上海一恒科技有限公司）；调温型电热套（北京科伟永兴仪器有限公司）；循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；冷冻干燥机（上海比朗仪器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1金贯蓝提取物溶液和对照组溶液制备 金贯蓝提取物溶液：取金贯蓝提取物溶解于无菌蒸馏水中，分别配置成浓度为500 g/L、250 g/L、100 g/L的溶液，0.22 µm孔径滤菌器过滤除菌，备用。

阳性对照组：克林霉素、红霉素、夫西地酸溶解在适当溶剂中，得到药物溶液，均采用0.22 µm 孔径滤菌器过滤除菌，备用。

阴性对照组：无菌生理盐水，备用。

1.4.2菌悬液制备 本研究用强化梭菌液体培养基（reinforced clostridium medium，RCM）和固体培养基（reinforced clostridium agar， RCA）培养C. acnes，37 ℃厌氧培养48 h，调整菌悬液浓度为1×106CFU/mL，备用；采用胰酪大豆胨液体培养基（tryptic soy agar， TSB）和胰酪大豆胨固体培养基（tryptic soy broth， TSA）培养S. epidermidis、S. aureus，37 ℃需氧培养16 h，调整菌悬液浓度为1×106CFU/mL，备用。

1.4.3抑菌活性测定（琼脂打孔法） 本实验采用国家临床实验室标准委员会（NCCLS 2020）推荐的琼脂打孔法［13］测抑菌圈直径。将浓度为1×106CFU/mL的三种菌悬液分别均匀涂布在相应固体平板上，将80 µL 不同浓度金贯蓝提取物（终浓度分别为500 g/L、250 g/L 和100 g/L）加至预先制备好的琼脂孔内，加入80 µL 生理盐水作为阴性对照组，盖好皿盖。S. epidermidis、S. aureus正置于37 ℃恒温生化培养箱中培养，16 h 后观察结果；C. acnes正置于厌氧盒中，放入37 ℃恒温生化培养箱中培养，48 h 后观察结果。同一浓度平行重复3 次，测量每组抑菌圈直径取平均值。

1.4.4最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定 本实验由NCCLs 推荐的微量稀释法［13］改进而来，采用96 孔板测定最小抑菌浓度（minimum inhibitory con‑centration，MIC）。在96 孔板第1 列孔中分别加入180 µL 菌液，20 µL 相应药物，使金贯蓝提取物终浓度为100 g/L，抗生素组为1 mg/L，第2~10 列孔分别加入100 µL 菌液。吹打混匀后吸取第1 列每孔100 µL 液体至第2 列，以此类推，连续倍比稀释9个浓度。使金贯蓝提取物浓度分别为：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 3、0.390 6 和0.195 3 g/L，红霉素、克林霉素及夫西地酸浓度分别为1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 3、0.015 6、0.007 8、0.003 9 和0.002 mg/L，设置阳性对照组（仅含菌液）及阴性对照组（空白培养液），如图1 所示。S.epidermidis、S. aureus于37 ℃培养16 h，C. acnes厌氧条件下培养48 h，孔内液体清亮则判读为MIC。将≥MIC 药物浓度的含菌培养液涂板，再将平板于37 ℃培养24 h（C. acnes厌氧条件下培养48 h），观察有无细菌生长，以平板中计数≤5 个菌落作为最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）。

图1 金贯蓝提取物分别对痤疮丙酸杆菌（A）、表皮葡萄球菌（B）和金黄色葡萄球菌（C）的抑菌圈平板图

1.4.5抑菌曲线的测定 将浓度分别为MIC、0.8 MIC、0.5 MIC 药物组和不加药的空白对照组振荡培养后，每隔2 小时用酶标仪测定S. epidermidis、S. au⁃reus在630 nm 的光密度（optical density， OD）值，每隔4 h测定C. acnes的OD 值。实验平行测定3次，绘制生长曲线。

1.5 统计学方法采用SPSS 26.0 统计软件进行分析。数据以xˉ±s表示。服从正态分布的不同组间计量资料相关性采用Pearson相关分析；不服从正态分布或不同组间的等级资料相关性采用Spearman 相关分析。

2 结果

2.1 抑菌活性测定药敏结果显示，空白组无抑菌圈产生，不同浓度的实验组均有抑菌圈。500 g/L 金贯蓝提取物对C. acnes、S. epidermidis、S. aureus的抑菌圈直径分别为（27.67±2.52）mm、（23.33±1.53）mm、（22.00±1.00）mm；浓度为250 g/L 金贯蓝提取物对C. acnes、S. epidermidis、S. aureus的抑菌圈直径分别为（22.33±0.58）mm、（20.67±1.53）mm、（20.11±1.20）mm；浓度为100 g/L 金贯蓝提取物对C. acnes、S. epidermidis、S. aureus的抑菌圈直径分别为（13.30±0.75）mm、（10.67±1.53）mm、（10.67±0.58）mm。通过Pearson 相关分析，说明抑菌圈直径与金贯蓝提取物浓度之间差异有统计学意义（r>0.90，P<0.001），见图1，表1。

表1 金贯蓝提取物对三种菌的抑菌圈直径

2.2 MIC 和MBC金贯蓝提取物对C. acnes、S.epidermidis、S. aureus的MIC均为25 g/L；MBC分别为50 g/L、50 g/L、25g/L。阳性对照红霉素对C. acnes、S. epidermidis、S. aureus的MIC 分别为0.125 mg/L、0.125 mg/L、0.25 mg/L；MBC 分别为0.25 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L；克林霉素对C. acnes、S. epidermidis、S. aureus的MIC 为0.031 mg/L、0.031 mg/L、0.063 mg/L；MBC 为0.063 mg/L、0.125 mg/L、0.125 mg/L；夫西地酸对C. acnes、S. epidermidis、S. aureus的MIC 为0.625 mg/L、5 mg/L、5 mg/L；MBC 为2.5 mg/L、10 mg/L、10 mg/L，见表2。

表2 金贯蓝提取物对三种菌的最小抑菌浓度及最小杀菌浓度

2.3 抑菌曲线结果不同浓度金贯蓝提取物对C.acnes生长情况测定结果如图2A 所示，不加药物的空白对照组在第16 小时进入对数生长期，第44 小时进入稳定生长期；加入0.5 倍MIC 浓度的药物后，C. acnes在第24 小时进入对数生长期，第64 小时进入稳定生长期；加入0.8 倍MIC 浓度的药物后，C.acnes在第28 小时进入对数生长期，0.5 MIC 及0.8 MIC两组OD值明显低于空白对照组，且随药物浓度增大OD值降低越明显；MIC浓度的药物中细菌未见生长；这组数据表明金贯蓝提取物能明显抑制C.acnes的生长，延长C. acnes迟缓期，并随着药物浓度增加抑菌效果越明显。

图2 金贯蓝提取物分别对痤疮丙酸杆菌（A）、表皮葡萄球菌（B）和金黄色葡萄球菌（C）的抑菌曲线

不同浓度金贯蓝提取物对S. epidermidis生长情况测定结果如图2B 所示，空白对照组S. epidermidis在第4 小时进入对数生长期，第16 小时进入稳定生长期；加入0.5 倍MIC 浓度的药物后，S. epidermidis在第8 小时进入对数生长期，第20 小时进入稳定生长期；加入0.8倍MIC 浓度的药物后，细菌在第16小时进入对数生长期，并且通过OD 值测定，这两组细菌量较空白组明显减少；MIC 浓度的药物细菌未见生长；这组数据表明金贯蓝提取物能明显延长S.epidermidis的迟缓期，抑制S. epidermidis的生长，且随药物浓度增加抑菌效果越明显。

不同浓度金贯蓝提取物对S. aureus的生长情况测定结果如图2C 所示，空白对照组S. aureus在第2 小时进入对数生长期，第12 小时进入稳定生长期。加入0.5 倍MIC 浓度的药物时，S. aureus在第4小时进入对数生长期，第20 小时进入稳定生长期；加入0.8 倍MIC 浓度的药物时，细菌在第8 小时进入对数生长期，第20 小时进入稳定生长期，OD 值结果示0.5 MIC 及0.8 MIC 两组OD 值明显低于空白对照组，且随药物浓度增大，OD 值降低越明显。加入MIC 浓度的药物时，细菌未见生长。这组数据表明金贯蓝提取物能明显延长S. aureus的迟缓期，抑制S. aureus生长，且随药物浓度增加抑菌效果越明显。

3 讨论

虽然AV 的发病机制尚未完全阐明，但现阶段普遍认为AV 除了与性激素水平异常、皮脂分泌过多以及皮脂腺导管过度角化有关外，C. acnes导致的炎症反应在AV 发生发展中也起重要作用［14］。此外，皮肤微生物组学研究发现AV发病还与S. epider⁃midis、S. aureus等需氧菌混合感染相关［15-17］。因此，抑制AV 相关致病菌成为治疗AV 的重要手段。抗生素是治疗AV 的常规药物，然而全球范围内抗生素长期且频繁使用，导致细菌耐药性增加［18］。近年来，有研究发现中药治疗AV 不良反应小、耐药性发生率低［19］，引起众多学者关注。

本研究中药方剂由金银花、贯众、板蓝根、黄芪、甘草五味中药按一定比例配伍而成。金银花为君药，性寒，除清热解毒外［20］，还具有较强抗菌效果，临床上已用于治疗多种感染性疾病［21］。板蓝根、贯众共为臣药，板蓝根味苦性寒，具有凉血、清热解毒之功［22］，常与金银花配合，用于治疗细菌感染性疾病［23］。有研究发现板蓝根水提物对S. epider⁃midis、S. aureus等多种细菌具有抑制作用［24］。贯众性微寒，主要功效为清热解毒、凉血止血，在抑制S.epidermidis、S. aureus活性方面与头孢西丁效果相当［25］。黄芪为佐药，性温，有益卫固表、托疮生肌等功效［26］，有助于AV 皮损的修复。由于金银花、板蓝根、贯众药性寒凉，黄芪性温，故在此方中用量大，一温一寒，兼可调和药性，以达到互补的治疗作用，符合中医理论。甘草为使药，味甘性平，益气健脾，调和诸药，古有“国老”之称［27］。综上，金贯蓝提取物全方谨遵君臣佐使配伍原则，主从有序，各司其职，阴阳平衡，配伍合理；又切合AV 发病机制，推测其对AV具有一定的治疗意义。

本实验得出500 g/L、250 g/L、100 g/L 的金贯蓝提取物对C. acnes、S. epidermidis、S. aureus均有抑制作用，且药物浓度越高，抑菌圈直径越大，相关性分析示r>0.90，P<0.001，说明抑菌效果与药物浓度具有显著相关性。500 g/L、250 g/L 金贯蓝提取物的抑菌圈直径均大于20 mm，表明金贯蓝提取物对AV 致病菌具有较强抑制作用，而100 g/L 金贯蓝提取物的抑菌圈直径大于10 mm，进一步提示较低浓度提取物对AV 相关致病菌也具有一定抑制作用。该实验结果与国内相关中草药抑菌实验结果相一致［28-29］。空白对照组固体培养基和液体培养基清亮，未受到污染，说明实验结果可信；每组实验设置3 次重复，证明了实验的可重复性，实验结果偏差小。

通过肉汤微量稀释法测定该提取物对三种菌的MIC 和MBC 值。结果为金贯蓝提取物对C.acnes、S. epidermidis、S. aureus的MIC 值均为25 g/L，说明金贯蓝提取物对三种菌的抑制效果相当。金贯蓝提取物对C. acnes、S. epidermidis两种细菌的MBC 值高于MIC 值，进一步提示金贯蓝提取物可能对C. acnes、S. epidermidis这两种细菌仅具有抑菌作用；而对S. aureus的MIC 和MBC 值相同，表示金贯蓝提取物可能对S. aureus有杀菌作用。此外，金贯蓝提取物抑菌作用弱于抗生素组，这与其他具有抑制C. acnes作用的中草药提取物结果一致［30］。它们对AV 相关致病菌的MIC 等级为g/L，少数为mg/L。虽然这些抑菌实验受到提取物、菌株、培养条件等因素的影响，但我国中草药抑菌实验大多数选用提取物，实验条件基本相同，本实验与国内实验数据具有一定可比性。

绘制细菌生长曲线能直观看出菌群的生长规律，药物对菌群生长的影响，以及疗效随时间的变化。结果表明金贯蓝提取物能抑制细菌生长，细菌迟缓期持续时间比对照组长，且随药物浓度增加抑制作用增强。

本实验得出金贯蓝提取物对C. acnes、S. epider⁃midis、S. aureus具有一定抑菌效果，且与药物浓度存在显著相关性，具有进一步研究和开发的价值；但受时间、经费等条件限制，本研究未进行抑菌机制的深入探索；该药物疗效也需相关临床试验数据支持，以上是我们进一步的研究方向。