氮磷叶面喷施对云南松苗木叶绿素含量及其异速生长关系的影响

黄 键王德新杨 松郑超凡陆庄跃许玉兰

（1. 云南省林木种苗工作总站，云南 昆明 650215；2. 西南林业大学林学院，云南 昆明 650233；3. 西南林业大学云南生物多样性研究院，云南 昆明 650233）

光合作用是植株进行的重要生理活动，叶绿素是参与光合作用非常重要的一种光合色素[1]，叶绿素含量与叶片光合速率密切相关[2]，叶绿素含量可以反映植株的光合作用能力及营养健康状态[3]，成为衡量光合产物的重要指标[4]。叶绿素是一个复杂的数量性状，极易受外界环境，比如光、温、水、肥等因素的影响[5-7]。研究表明，增施氮（N）对叶绿素合成和光系统功能有明显的促进作用[8-10]。但不同用量下的响应不一致，外源性肥料添加促进作用与用量、植物自身元素亏缺状态有关[9-11]。N、磷（P）作为植物的基本营养元素，在植物生长和各种生理调节机制中发挥着重要作用[12-15]，其中控制好N、P 配比尤为重要。尹意婷等[12]在N、P 配施对青冈（Quercus glauca）、苦槠（Castanopsis sclerophylla）幼苗生物量分配及叶片养分含量的影响试验发现，少量的N 和P 对苗木生物量的积累影响不大，而合理的施N 和施P 能够显著的增加苗木生物量。因此合理施肥对促进苗木正常生长，提高生产力、改善植物体内元素含量具有十分重要的作用。施肥的方式也较多，其中叶面施肥相对于传统施肥方式具有利用效率高、用量少、养分吸收快、便于喷施等优势，目前叶面施肥的研究越来越广泛[16-17] 。

云南松（Pinus yunnanensis）为松科松属的常绿高大针叶乔木，具有喜光、耐干旱，而且对土壤条件的要求较低，不仅能在酸性红壤、红黄壤和棕色森林土或微石灰性土壤上生长，也能在其他树种不能生长的贫瘠地或水土流失严重的荒山生长[18]。云南松苗期生长缓慢，对其生长促成培育非常有必要，其中施肥是较为常见简易的途径，前期的研究表明，N、P 添加可促进云南松苗木的生长[17,19]，但不同的N、P 用量如何影响植株的叶绿素含量不清。本研究阐述了不同N、P 叶面喷施下叶绿素a、叶绿素b 指标的变化特征，以探索N、P 添加对云南松苗木叶绿素含量、比值及其异速生长关系的影响，进而筛选云南松生长的适宜N、P 喷施量，以期为云南松苗木的促成培育提供基础数据，为云南松苗木合理施肥和高产高效栽培提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究材料

试验地设置在西南林业大学的苗圃内，地处云南省昆明市，位于北纬25°04'00″、东经102°45'41″，海拔约1 945 m，属北亚热带半湿润高原季风气候。本研究以2 年生云南松幼苗为材料，施肥前选取株长势基本一致，健康无病虫害的幼苗组成不同的试验小组，插牌标记并进行N、P 叶面喷施试验。试验用土以西南林业大学校内红壤土与育苗基质公司的腐殖土按体积比为1∶2 混合均匀作为育苗基质。

1.2 研究方法

试验采用N、P 各2 因素3 水平试验设计，外源N、P 按高、中、低浓度设置3 个梯度[19]，N采用尿素（CH4N2O）、P 采用磷酸二氢钾（KH2PO4），N水平N1、N2、N3分别为0%、0.25%、0.5%（以N 含量计算，质量分数），P 肥水平P1、P2、P3分别为0%、0.2%、0.4%（以P 含量计算，质量分数），具体方案如表1 所示。试验共9 个处理，每个处理40 株，重复3 次，合计1 080 株云南松苗木。试验于2020 年6 月底至8 月底采用等量施肥法每隔7 d 喷施1 次，共喷施8 次，喷施周期为2 个月，喷施时尽可能使每个处理每个单株的施肥量相近。并对云南松苗木进行定期浇水、除草，松土。

表 1 云南松苗木N、P 叶面喷施用量Table 1 Experimental design of foliar spraying of nitrogen and phosphorus on P. yunnanensisseedlings

1.3 数据测定

本试验数据测量时间为2020 年8 月、10 月、12 月底各测量1 次，共测3 次，各处理各个重复内随机选8 株长势一致的苗木，用混合采样法采摘当年生成熟针叶，用丙酮提取法对叶绿素进行提取，用分光光度法对叶绿素含量进行测定，重复3 次。然后计算叶绿素a 含量、叶绿素b 含量、叶绿素（a + b）含量以及叶绿素a/b。

1.4 数据分析

对所获得的数据进行统计整理，使用Excel 2016、SPSS 等软件对其N、P 以及交互作用对叶绿素影响进行双因素方差分析，利用Duncan 多重比较（α=0.05）检验各处理间的差异显著性[20-21]，用平均值 ± 标准误差进行绘图[22]。利用SPSS 构建叶绿素指标与N、P 用量间的二元二次回归方程，进一步采用降维法对N、P 配施效果进行单因素效应分析，确定最佳N、P 用量及其最高理论产量值和叶绿素含量的适宜N、P 浓度配比[19]。

2 结果与分析

2.1 N、P 叶面喷施对云南松苗木叶绿素含量的变异来源分析

在测定的8 月、10 月、12 月，N、P 交互作用对云南松苗木的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素（a + b）含量的影响达极显著水平（P＜0.01），而8 月和12 月N、P 交互作用对叶绿素a/b 无显著相互作用。从N 叶面喷施单个因素来看，对8 月、10 月、12月叶绿素a 含量的影响达极显著水平、对8 月叶绿素b 含量的影响达极显著水平、对8 月和10 月叶绿素（a + b）含量的影响达极显著水平、对10 月和12 月叶绿素a/b 的影响达极显著水平（P＜0.01），而对8 月和12 月叶绿素b、12 月叶绿素（a + b）含量均无显著影响。从P 叶面喷施单个因素来看，对各月的叶绿素b 含量均无显著影响，对叶绿素a 含量影响在8 月和10 月达到极显著水平（P＜0.01），在12月达显著水平（P＜0.05）。总体来看，N、P 叶面喷施对云南松苗木叶绿素含量影响明显，且随着时间推移发生改变。

2.2 N、P 叶面喷施对云南松苗木叶绿素含量的影响

2.2.1 N、P 叶面喷施对云南松苗木叶绿素a 含量的影响

由图1 可知，N、P 叶面喷施对云南松苗木叶绿素a 含量有不同程度的影响。8 月，处理3、4、5 的叶绿素a 含量均高于处理1，处理3 最高，处理9 最低。10 月，所有施肥处理叶绿素a 含量均大于处理1，处理9 中最大为13.407 mg/g，处理1 中最小。12 月，处理4、7、8、9 的叶绿素a 含量均大于处理1，处理4 最大，处理6 最小（9.122 mg/g）。综合来看，在测定时期内，处理4 叶绿素a 含量均大于处理1，即处理4（中N低P）对云南松苗木叶绿素a 含量产生明显的促进作用。

图 1 各处理间叶绿素a 含量的动态变化图Fig. 1 The dynamic change of chlorophyll a content among different treatments

2.2.2 N、P 叶面喷施对云南松苗木叶绿素b 含量的影响

由图2 可知，N、P 叶面喷施对云南松苗木叶绿素b 的含量也有一定的影响。其中，8 月各处理的叶绿素b 波动于3.220～4.600 mg/g，以处理5 最高、处理6 最低，处理2、6、8、9 的叶绿素b 含量均小于处理1。10 月，所有施肥处理中叶绿素b 含量均大于处理1，且在处理2 中观测到最大值5.237 mg/g，处理1 中观测到最小值3.559 mg/g。12 月，处理2、6 的叶绿素b 含量小于处理1，以处理4 最高、处理6 最低。综合来看，在整个试验周期中，处理3、4、5、7 的叶绿素b 含量均大于处理1，以处理4 最大，即处理4（中N低P）对云南松苗木叶绿素b 含量促进作用明显。

图 2 各处理间叶绿素b 含量的动态变化图Fig. 2 The dynamic change of chlorophyll b content among different treatments

2.2.3 N、P 叶面喷施对云南松苗木叶绿素a/b 含量的影响

由图3 可知，8 月，处理2、6、7、8、9 的叶绿素（a + b）含量均小于处理1，以处理3 最大，处理9 最小。10 月，所有试验处理中叶绿素（a + b）含量均大于处理1，处理9 中观测到最大值18.605 mg/g，处理1 中观测到最小值11.684 mg/g。12 月，处理4、7、8、9 均大于处理1，以处理4 最高、处理6 最小。综上来看，处理4（中N 低P）最佳，对云南松苗木叶绿素（a + b）含量产生明显的促进作用。

图 3 各处理间叶绿素（a + b）含量动态变化图Fig. 3 The dynamic change of chlorophyll (a + b) content among different treatments

2.2.4 N、P 叶面喷施对云南松苗木叶绿素a/b 的影响

由图4 可知，不同N、P 叶面喷施对云南松苗木叶绿素a/b 有影响。其中在8 月，除处理2 中叶绿素a/b 含量大于处理1，其他处理均小于处理1，处理2 中观测到最大值3.146，处理7 中观测到最小值2.338。10 月，所有试验处理中叶绿素a/b 均大于处理1，以处理5 最大，处理1 最小。12 月，除了处理9 中叶绿素a/b 大于处理1，其他处理均小于处理1，且以处理9 最大，处理5 最小。综上所述，8 月和10 月的处理2 以及10 月和12 月的处理9 中叶绿素a/b 大于处理1，其中，6—8 月处理2 中的叶绿素a/b 含量存在最大值，处理2、3、4、5、6、7、8 的叶绿素a/b 除了在10 月大于处理1 之外，其余均小于处理1。

图 4 各处理间叶绿素a/b 的动态变化图Fig. 4 The dynamic change of chlorophyll a/b content among different treatments

2.3 N、P 叶面喷施对云南松苗木叶绿素a/b 含量间的相对生长关系分析

由表2 可知，云南松苗木叶绿素a 含量与叶绿素b 含量间的相对生长关系随观测时间发生变化，其中处理4 在8 月、10 月、12 月均表现为异速生长关系，处理7 则表现为等速生长关系。处理2 和处理3 在8 月、10 月均为等速生长关系，12 月为异速生长关系。处理5 和处理9 在8 月、10 月均为异速生长关系，在12 月为等速生长关系。处理1 在8 月为等速生长关系，在10 月和12 月为异速生长关系。

各处理在不同测定时间的斜率也发生变化，除处理7、8、9 外，其他处理的相对积累速率随测定时间发生变化，其中处理8 在8 月、10 月、12 月均表现为大于1，即叶绿素a 含量的积累速率大于叶绿素b 含量；处理7、9 在8 月、10 月、12 月均表现为小于1，即叶绿素a 含量的积累速率小于叶绿素b 含量。其余的处理均随苗木生长发生变化。处理1、2、3 随测定时间表现为：8 月斜率小于1、10 月斜率大于1、12 月斜率小于1。处理4、6 在8 月的斜率大于1 而在10 月和12 月均小于1，处理5 在8 月和10 月的斜率小于1 而在12 月大于1。综合来看，施肥改变叶绿素a 含量和叶绿素b 含量的积累速率，且这种相对生长关系随时间会发生改变，在单施P 的情况下（处理1、2、3）叶绿素a 含量的积累速率相对于叶绿素b 含量呈现先升高后降低的趋势，而在单施N 或N、P 配施情况下变化较为复杂。

表 2 云南松苗木叶绿素a/b 含量间的异速生长关系Table 2 The allometric relationship between chlorophyll a and chlorophyll b content of P. yunnanensis seedlings

2.4 N、P 叶面喷施对云南松苗木叶绿素含量的主导因子分析

由表3 可知，N、P 都对云南松苗木叶绿素a 含量起到了不同程度影响，其中，8 月、10 月、12 月的主导因子均为N，促进云南松叶绿素a 含量增加的理论最佳水平组合分别为N3P1、N3P3和N1P3。从叶绿素b 含量来看，8 月、10 月的主导因子均为N，12 月的主导因子为P，促进云南松叶绿素b 含量增加的最优水平组合分别为N3P2、N1P3和N3P3。从叶绿素（a + b）含量来看，8 月、10 月、12 月的主导因子均为N，理论最优水平组合分别为N3P1、N1P3、N3P3。从叶绿素a/b 来看，8 月和10 月主导因子为P、12 月的主导因子为N，总体各水平间差异较少。综合来看，对叶绿素影响的主导因素以N 为主。

表 3 N、P 叶面喷施对云南松苗木叶绿素的极差分析Table 3 Range analysis of chlorophyll of P. yunnanensisseedlings by foliar spraying of nitrogen and phosphorus

2.5 云南松苗木N、P 叶面喷施肥料效应与最佳施肥量的确定

由表4 可知，所构建的苗木叶绿素含量与肥料用量的二元二次回归方程，叶绿素a 含量的方程为Y=11.68 + 4.837N-4.154P-12.657N2+ 11.785P2-13.399N × P，叶绿素b 含量的方程为Y=3.781 +3.579N-0.875P-4.191N2+ 4.525P2-9.13N × P。进一步对方程进行降维可知，2 年生云南松适宜的N、P 浓度施用范围分别为N：0.20%～0.43%，P：0.10～0.17%，单施下的理论产值，对于叶绿素a 而言，适宜的N、P 配比（质量比）为0.20∶0.17；对于叶绿素b 而言，适宜的N、P 质量比为0.43∶0.10。

表 4 N、P 用量与叶绿素含量间的回归方程Table 4 Regression equation between nitrogen, phosphorus consumption and chlorophyll content

3 结论与讨论

N、P 是植物的基本营养元素，其中N 元素是遗传物质的基础和蛋白质构成的重要成分，P 是遗传物质、生物膜、核糖体和能量载体等的组成成分[23]，与植物的光合作用密切相关，而光合作用与叶绿素含量有着密切的联系。本研究表明，不同N、P 叶面喷施对云南松苗木叶绿素含量具有明显的影响，其中处理4 可提高叶绿素a 含量、叶绿素b 含量和叶绿素（a + b）含量，这在其他植物的叶面喷施中也有类似的报道[6]，N、P 添加对叶绿素含量有一定的促进作用。但N、P 喷施用量不同，其表现的作用有所差异，前期云南松及相关研究中也有报道[8-11,17,19]，一定N、P 用量可提高叶绿素含量，而高浓度下作用不明显[10-11,19]，适宜外源N 可以提高叶绿素含量，进而增强植物的光合能力，但高N 水平光合速率反而下降，可能是N 导致植物营养失衡或自遮蔽产生了负面效应[10,24]。但随着苗木的生长，不同N、P 添加处理对叶绿素含量的影响也发生一定的变化，这可能是因为植物营养需求具有明显的阶段性[16]。当然，叶绿素受环境影响较大，是一个复杂的数量性状[5-7]，有必要继续跟踪调查，并针对苗木的光合特性，进一步开展苗木生长、叶绿素含量等之间的遗传剖析。

环境中有限的N、P 往往会成为限制生态系统生产力的因素[25]，其中N 含量的高低决定着植物生长速率的快慢[26]。本研究分析表明，对云南松苗木叶绿素影响的主导因子为N，这可能与N 素添加提高叶绿素、保留叶绿体结构等有关[24,27-28]。N 是植物光合作用及生长的限制因子，梁文斌等[24]研究表明，N 添加可以增加植物的可利用N，在一定范围内，植物的光合速率随叶片N 含量的增加呈线性增加，进而有利于植物碳的积累和生产力的增加[9]。胡玉玲等[16]利用N、P、钾（K）等多种元素的肥料对油茶（Camelliaoleifera）进行叶面喷施结果表明，不同生长阶段施肥对油茶叶片叶绿素含量的影响最大，各试验因素对油茶叶片叶绿素含量都存在显著影响，其中N 肥的作用较为明显，施N 肥可以明显提高植物叶片叶绿素含量[29-30]。在云南松的研究中也表明，N 受限比较明显[31-32]，土壤中N 素营养较缺乏，这也体现了N 素是植物重要的营养元素[16,33]，同时也是植物体内蛋白质、核酸、叶绿素等的重要组成部分[33]，N 参与影响叶绿素的生物合成，一定量的N 条件下，叶绿素合成途径畅通，叶绿体结构完整，叶绿素含量增加[27,34-35]。

叶绿素含量间的相对生长关系分析表明，N、P 叶面喷施对云南松苗木叶绿素a 含量与叶绿素b 含量间相对生长关系的影响随时间发生变化，各处理在不同测定时间的斜率也发生变化，这种异速生长关系反映了各属性之间的表型可塑性[36]，从前期的变异来源分析可以看出，叶绿素a 含量在各测定阶段N、P、N × P 下均表现为各处理间差异显著或极显著，而叶绿素b 含量在N × P 下表现为各处理间差异极显著，而在P 下无显著差异，在N 下仅10 月为差异极显著。由此表明，叶绿素a 含量与叶绿素b 含量对N、P 叶面喷施的响应不一样，叶绿素a 的变化较为敏感，这种可塑性体现在叶绿素a 与叶绿素b 间的相对生长关系发生改变，且这种变化随苗木生长也有所不同[37]。因此，苗木各阶段的叶绿素a/b 也发生改变，造成这种差异性的原因有待进一步探讨。

综上所述，N、P 叶面喷施对云南松苗木叶绿素含量有影响，且不同N、P 施用量对叶绿素含量的影响不同，适宜的N、P 用量可提高云南松苗木叶绿素含量。从N、P 两因素影响效应上来看，N 对绿素a 含量、叶绿素b 含量及其叶绿素（a + b）含量的影响大于P，N 起是影响叶绿素含量的主导因子。不同N、P 叶面喷施也影响了叶绿素a 含量与叶绿素b 含量间的相对生长关系，且随苗木的生长发生变化。构建了N、P 用量与叶绿素含量间的回归方程，2 年生云南松适宜的N、P 质量浓度施用范围分别为N：0.20%～0.43%，P：0.10%～0.17%。