臭椿不同部位提取物抗烟草花叶病毒活性研究

吴江梅，邹正彪，左安建，符滔，张威，闫晓慧，胡世俊

(1. 西南林业大学生物多样性保护学院/云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南昆明 650224；2. 西南林业大学林学院，云南昆明 650224)

植物病毒病害对现代农业造成严重威胁和巨大经济损失[1]。 烟草花叶病毒(TMV)是一种重要的植物病毒，因其广泛的寄主和传播方式，在世界范围内对农作物造成重大损失，目前为止，很少有化学试剂能够显著抑制TMV 在植物体内的复制[2-4]。 由于传统化学农药的使用会对人体、农作物和其他生物以及环境造成危害[5]，在绿色农业理念下，植物源农药因具有高效、无污染、材料易获取、费用较低、不产生抗药性等优点而受到广泛关注[6]。

我国植物资源丰富，植物提取物中的多种化学成分具有生物活性，并且植物不同部分所含有化学成分也不同[7-9]。 臭椿[Ailanthus altissima(Mill.)Swingle]为苦木科(Simaroubaceae)臭椿属(Ailanthus)植物，是一种传统草药，臭椿种子、皮、叶、果实中含有苦木素、黄酮、生物碱类等多种化学成分，具有丰富的生物和药理活性[10]。 研究发现臭椿根皮、种子、果实提取物对TMV 具有一定的抑制作用[11-13]。 为此，本研究对臭椿枝叶石油醚提取物(leaf extract， LE)、种子石油醚提取物(seed extract， SE)、树皮乙醇提取物(bark ethanol extract，BE)的抗烟草花叶病毒活性进行了测定，并对臭椿种子和枝叶石油醚提取物、树皮乙醇提取物进行进一步分离和抗TMV 活性追踪，筛选抗TMV的有效成分，为臭椿的综合开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试植物 臭椿枝叶、种子于2015 年辽宁朝阳采集，臭椿树皮于2022 年辽宁朝阳采集，树龄在10～15 年，保存在西南林业大学森林灾害预警与控制重点实验室。

1.1.2 供试病毒 TMV(U1)普通株系，繁殖于普通烟K326 上，采用Gooding 等[14]的方法进行提纯，保存于-80℃冰箱中备用。

1.1.3 供试寄主 TMV 枯斑寄主心叶烟(Nicotiana glutinosa)，漂盘育苗，在无虫温室中培育，待烟苗长至4～6 片真叶时进行活性测定。

1.1.4 仪器与试剂 8%宁南霉素水剂(NN，德强生物股份有限公司)；二甲基亚砜(DMSO，分析纯，天津市光复精细化工研究所)；甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷(化学纯，云南利妍科技有限公司)经重蒸后使用；GF254 薄层层析硅胶板、柱层析硅胶(青岛海洋化工厂)；Lichroprep RP-18 反向硅胶柱层析材料(德国默克公司)；N-1100旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；DL-1万用电炉(天津市赛得利斯实验分析仪器制造厂)；ZF-6 三用紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 提取与分离 (1)臭椿枝叶石油醚提取物(LE)的提取与分离:臭椿枝叶30.00 kg，风干粉碎，甲醇加热回流提取3 次，每次3 h，合并提取液，减压浓缩所得浸膏溶于蒸馏水中，用石油醚提取3 次，减压浓缩合并得到石油醚提取物(1.61 kg)，经硅胶柱层析按V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)以100 ∶1 ～0 ∶1 比例梯度洗脱，得到12 个馏分(LE.1～LE.12)；各馏分的洗脱比例，LE.1、LE.2为100∶1，LE.3 为50 ∶1，LE.4 为30 ∶1，LE.5 为20 ∶1，LE.6 为10∶1，LE.7 为8∶1，LE.8 为5∶1，LE.9为3 ∶1，LE.10 为2∶1，LE.11 为1∶1，LE.12 为0∶1。

(2)臭椿种子石油醚提取物(SE)的提取与分离:臭椿种子10.5 kg 风干粉碎，采用甲醇加热回流提取法提取，分别提取3 次，每次3 h，合并3 次提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏状，得到甲醇提取物，用蒸馏水溶解提取物，用石油醚提取3次，合并提取液，浓缩至浸膏状得到石油醚提取物(0.64 kg)，经硅胶柱层析按V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)以100∶1～1∶1 比例梯度洗脱，得到12 个馏分(SE.1 ～SE.12)；各馏分的洗脱比例，SE.1 为100∶1，SE.2 为50∶1；SE.3 为30∶1，SE.4 为20 ∶1，SE.5、SE.6 为10∶1，SE.7、SE.8 为8∶1，SE.9 为5 ∶1，SE.10 为3∶1，SE.11 为2∶1，SE.12 为1∶1。

(3) 臭椿树皮乙醇提取物(BE)的提取与分离:臭椿树皮1390.35 g 风干粉碎，采用乙醇加热回流提取法提取5 次，每次3 h，合并5 次提取液，再用旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏状，后用冻干机干燥称重得到98.3 g 提取物。 将得到的提取物经硅胶柱层析按V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)以30 ∶1～1 ∶1、V(二氯甲烷)∶V(甲醇)以100∶1 ～0∶1比例梯度洗脱，得到17 个馏分(BE.1 ～BE.17)。BE.1～BE.8 为V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)梯度洗脱得到，各馏分的洗脱比例如下，BE.1 为30∶1，BE.2 为20 ∶1，BE.3 为10∶1，BE.4 为7∶1，BE.5 为5 ∶1，BE.6为3∶1，BE.7 为2∶1，BE.8 为1∶1；BE.9～BE.17为V(二氯甲烷)∶V(甲醇)梯度洗脱得到，各馏分洗脱比例，BE.9 为100∶1，BE.10 为50∶1，BE.11、BE.12 为30∶1，BE.13 为20 ∶1，BE.14 为10 ∶1，BE.15 为5∶1，BE.16 为3∶1，BE.17 为0∶1。

1.2.2 抑制TMV 病毒侵染活性测定 采用活体半叶枯斑法[15]测定抗烟草花叶病毒活性，左半叶用1 mg/mL 的提取物作为处理，右半叶用同样浓度的DMSO 处理作为对照，以宁南霉素作为阳性对照。 采用3 种施药方式进行测定，①先施药:将200 μL 提取物用棉签涂抹在叶片上，6 h 后接种病毒200 μL，测定植物提取物对TMV 初侵染的保护作用；②后施药:接种200 μL 病毒6 h 后，将200 μL 提取物涂抹在叶片上，测定植物提取物对TMV 侵染的治疗作用；③混合施药:将200 μL 提取物与200 μL 病毒充分混匀30 min 后接种，测定植物提取物对TMV 的钝化作用。 将烟苗放在无虫温室中培养，待枯斑症状明显时，统计试验结果，并计算抑制率。

抑制率(%)＝(对照平均枯斑数-处理平均枯斑数)/对照平均枯斑数×100 。

1.2.3 抑制TMV 病毒增殖活性测定 采用离体半叶枯斑法[16]进行测定。 全叶摩擦接种1 mg/mL TMV 200 μL，6 h 后将叶片剪下，左半叶浸入盛有1 mg/mL DMSO 溶液的培养皿中作为阴性对照，右半叶浸入盛有1 mg/mL 提取物溶液的培养皿中作为处理，以浸入宁南霉素作为阳性对照。 室内培养，待枯斑症状明显时，统计试验结果，按上述公式计算抑制率。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2010 软件进行数据统计，运用SPSS 17.0 统计软件进行One-Way ANOVA 和Duncan’s post hoc test (P＜0.05)多重比较。

2 结果与分析

2.1 臭椿3 种提取物对TMV 的抑制活性

由图1 可知，3 种提取物对TMV 的侵染均表现出保护、治疗、钝化、增殖抑制作用。 先施药结果表明，SE、BE 对TMV 的初侵染都具有较强的保护作用，抑制率分别为63.64%、51.54%，显著高于宁南霉素，LE 的抑制率低于宁南霉素。 后施药结果表明，SE 对TMV 侵染的治疗活性最好，抑制率为50.60%，显著高于宁南霉素；其次为BE，与宁南霉素无显著差异。 混合施药结果表明，SE 对TMV 的钝化作用最好，抑制率为60.01%，显著高于宁南霉素，LE 和BE 均比宁南霉素低。 离体试验结果表明，3 个提取物的抑制率都高于宁南霉素，抑制率在43.47%～79.33%之间，LE 与宁南霉素无显著差异，其余都显著高于宁南霉素。

图1 臭椿不同部位提取物对TMV 侵染的抑制作用

2.2 臭椿枝叶石油醚提取物(LE)馏分对TMV的抑制活性

由表1 可知，除了馏分LE.8，其余馏分对TMV 都具有一定的抑制作用。 先施药结果表明，馏分LE.3、LE.5 对TMV 的初侵染具有较好的保护作用，抑制率分别为54.99%、46.22%，显著高于阳性对照宁南霉素，馏分LE.2、LE.4、LE.6、LE.12的抑制率与宁南霉素无显著差异；经分离后得到的馏分LE.2、LE.3、LE.4、LE.5、LE.6、LE.12 的保护作用都比LE 原液好。 后施药结果表明，除了馏分LE.8、LE.10 没有活性，其余馏分对TMV 都具有一定的治疗作用，抑制率在20. 48% ～36.17%，但均低于宁南霉素；馏分LE.9 对TMV 侵染的治疗作用最好，且比LE 活性好。 混合施药结果表明，馏分LE.8 对TMV 无钝化作用，其余馏分的抑制率介于27.30%～51.99%，钝化作用最好的为LE.11，显著高于宁南霉素，LE.10 与宁南霉素无显著差异；除了馏分LE.1、LE.6 外，其余馏分活性均高于LE。 增殖抑制作用结果显示，除了馏分LE.8 对TMV 的体外增殖没有抑制作用外，其余馏分的抑制率介于6.87%～41.66%，均低于宁南霉素和LE，抑制率最好的为LE.3，与宁南霉素和LE 无显著差异。

表1 臭椿枝叶石油醚提取物馏分对TMV 的抑制率(%)

2.3 臭椿种子石油醚提取物(SE)馏分对TMV的抑制活性

由表2 可知，SE 的12 个馏分对TMV 都具有一定的抑制作用。 先施药结果表明，所有馏分对TMV 的初侵染都具有一定的保护作用，馏分SE.4、SE.6、SE.9 对TMV 的抑制活性最好，抑制率分别为71.96%、58.74%、67.84%，显著高于宁南霉素，其余馏分的抑制率介于20.42%～46.52%，SE.4、SE.9 的活性高于SE 的。 后施药结果表明，除了馏分SE.11，其余馏分对TMV 的侵染都有治疗作用，馏分SE.1、SE.5 的活性较好，与SE 和宁南霉素无显著差异，其余馏分的抑制率介于15.77%～46.09%。 混合施药结果表明，SE.10、SE.11、SE.12 对TMV 的钝化作用最好，抑制率分别为63.62%、72.18%、76.25%，显著高于SE 和宁南霉素。 增殖抑制作用结果显示，除了SE.3、SE.6，其余馏分对TMV 的体外增殖都具有一定的抑制作用，抑制率介于12.39%～43.34%，均低于SE 和宁南霉素。

表2 臭椿种子石油醚提取物馏分对TMV 的抑制率(%)

2.4 臭椿树皮乙醇提取物(BE)馏分对TMV 的抑制活性

由表3 可知，从BE 中分离得到的17 个馏分对TMV 都具有一定的抑制作用。 先施药结果表明，馏分BE.10 对TMV 初侵染的保护作用最好，抑制率为54.25%，显著高于宁南霉素，与BE 无显著差异，BE.1、BE.2、BE.12 与宁南霉素无显著差异。 后施药结果表明，馏分BE.5、BE.8 对TMV的治疗作用最好，显著高于BE 和宁南霉素，抑制率分别为58.67%、62.32%，其余馏分的抑制率介于16.56%～38.49%之间。 混合施药结果表明，除了馏分BE.6、BE.15，其余馏分对TMV 都具有一定的钝化作用，但都低于BE 和宁南霉素，抑制率介于7.42%～41.51%之间。 增殖抑制作用结果表明，BE.10 对TMV 体外增殖的抑制活性最好，达到了81.25%，与BE 无显著差异，BE.11、BE.13 的抑制活性也较好，显著高于宁南霉素。

3 讨论与结论

烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)病是由TMV 引起的一种系统侵染性病害，在世界各烟草种植区均有发生，每年造成的农业经济损失相当巨大，目前还未开发出理想药剂[17]，寻找新型抗TMV 药物仍是目前的研发重点和难点。 植物源农药作为生物农药的重要组成部分，因其具有高效、低毒或无毒、低残留、选择性高、有害物质一般很难对其产生抗性、易和其他农药相混配等优点[18]，倍受全世界农药研究及应用部门的广泛重视。 自第一个植物病毒抑制物从商陆(Phytolacca acinosa)中发现以来[19]，植物源抗病毒活性物质引起了研究者们的广泛关注，已成为研究热点之一。

近年来研究发现，臭椿提取物具有较高的抗TMV 活性[20]，之后一些学者开始研究臭椿中化学成分的抗 TMV 活性， 取得了一定的成果[13，15，21-24]，但主要集中在正丁醇、乙酸乙酯提取物，对臭椿各个部位的提取物抗烟草花叶病毒活性成分研究未见有相关报道。 本研究在此基础上对臭椿枝叶石油醚提取物、种子石油醚提取物、树皮乙醇提取物进行活性追踪发现，这3 个部位提取物对TMV 都具有抑制作用，臭椿种子石油醚提取物、树皮乙醇提取物对TMV 的侵染都具有较好的保护作用，显著高于宁南霉素(44.10%)，抑制率分别为63.64%、51.54%；臭椿种子石油醚提取物对TMV 侵染的治疗作用、钝化作用最好，抑制率分别为50.60%、60.01%；臭椿树皮乙醇提取物对TMV 的增殖抑制作用效果最好，抑制率为79.33%，表明臭椿在极性较小的石油醚提取物中也存在抗烟草花叶病毒活性显著的活性物质，并且不同部位提取物对TMV 的抑制作用不同。 提取物各馏分抗烟草花叶病毒活性结果表明，从保护活性来看，臭椿枝叶石油醚提取物馏分LE.3、LE.5、臭椿种子石油醚提取物馏分SE.4、SE.6、SE.9及臭椿树皮乙醇提取物馏分BE.10 对TMV的初侵染具有较好的保护作用，显著高于宁南霉素；从治疗活性看，臭椿树皮乙醇提取物馏分BE.5、BE.8显著高于宁南霉素，相比臭椿枝叶和种子的石油醚提取物馏分，臭椿树皮乙醇提取物馏分中分离出对烟草花叶病毒具有显著治疗作用的活性成分的可能性更大；从钝化活性看，臭椿种子石油醚提取物馏分SE.10、SE.11、SE.12 显著高于宁南霉素，表明对TMV 具有显著钝化作用的活性物质主要集中在臭椿种子石油醚提取物；从增殖抑制活性看，臭椿树皮乙醇提取物馏分BE.10、BE.11、BE.13 显著高于宁南霉素，表明抑制TMV增殖的活性成分主要集中在臭椿树皮乙醇提取物中。 结果显示，臭椿枝叶石油醚提取物中含有对TMV 侵染具有显著保护作用的活性物质；臭椿种子石油醚提取物中含有对TMV 具有显著保护、钝化作用的活性物质，臭椿树皮乙醇提取物中含有对TMV 具有显著保护、治疗、体外增殖抑制作用的活性物质。

植物提取物含有多种化学成分，不同部位的化学成分也不一样[9]。 植物的抗病毒作用可能为某一单一化合物，也可能是多种化学成分综合作用的效果。 梁红艳等[25]在从木瓜中分离抗TMV 活性成分的过程中发现，随着抗TMV 活性成分的逐步分离，组分的抗TMV 活性呈下降趋势。 本研究发现，随着对臭椿中抗TMV 活性组分的逐步分离，不同的馏分对TMV 表现出不同的抑制作用，馏分与原样之间、馏分与馏分之间存在显著差异，馏分抗TMV 的活性显著高于或低于臭椿提取物原样。 一方面可能是分离过程中活性成分被进一步纯化，所以对TMV 表现出更好的抑制作用，另一方面则是活性组分在被纯化的过程中，剩余的馏分流失了抗TMV 显著的活性成分，或者抗TMV 活性可能是多种成分协同作用的结果，所以逐步分离后抗TMV 作用呈现下降趋势。

本研究以臭椿不同部位提取物为研究对象，对臭椿的枝叶、种子、树皮提取物的抗TMV 活性组分进行追踪，发现臭椿中不同部位抗TMV 活性显著的馏分。 今后将对这些馏分中的化学成分进行分析和进一步分离，为进一步研究臭椿抗烟草花叶病毒提供理论依据，也为今后进一步开发绿色无公害、环境友好的植物源生物农药提供理论基础和科学依据。